la trascrizione e maturazione degli RNA procariotica

Cos’è la trascrizione e perché è indispensabile per la cellula?

• La trascrizione è il processo in cui il DNA (costituito da desossiribonucleotidi) viene copiato in una molecola di RNA(fatta di ribonucleotidi).

• L’RNA prodotto si chiama trascritto.

• Serve a rendere leggibile l’informazione genetica:

  • Il DNA è un archivio stabile ma non direttamente utilizzabile.

  • L’RNA è la copia operativa che porta le istruzioni del DNA verso i siti di sintesi proteica (ribosomi).

• Senza trascrizione, il DNA resterebbe inaccessibile e non potrebbe regolare le attività cellulari.

Quali sono i tipi di RNA e come vengono classificati oggi?

• Classificazione tradizionale (superata):

  1. mRNA (messaggero): trasporta le informazioni dal DNA ai ribosomi.

  2. rRNA (ribosomale): componente strutturale e catalitica dei ribosomi.

  3. tRNA (transfer): trasporta gli amminoacidi durante la traduzione.

• Classificazione moderna:

  • Coding RNA (codificanti): comprendono mRNA, rRNA e tRNA → direttamente coinvolti nella sintesi proteica.

  • Non coding RNA (ncRNA): non vengono tradotti in proteine, ma svolgono ruoli fondamentali.

• Esempi di ncRNA:

  • microRNA (miRNA): regolano l’espressione genica degradando o bloccando mRNA specifici.

  • small RNA (sRNA): vari ruoli regolatori, anche nei procarioti.

  • circular RNA (circRNA): nuova classe, funzioni non ancora del tutto comprese.

Quali funzioni svolgono gli RNA oltre alla sintesi proteica?

Gli RNA non sono solo "copie del DNA", ma molecole versatili con molte funzioni:

1. Regolatorie → ncRNA come i microRNA controllano quando e quanto un gene viene espresso.

2. Strutturali → rRNA costituisce l’impalcatura dei ribosomi.

3. Catalitiche → esistono RNA con funzione enzimatica, chiamati ribozimi.

4. Nuove scoperte → circular RNA e altri ncRNA sono presenti anche nei procarioti, segno che l’RNA ha un ruolo evolutivamente antico e molto più ampio di quanto si pensasse.

Quali sono le regole generali della trascrizione e qual è la direzione di sintesi dell’RNA?

• La trascrizione segue le stesse regole della polimerizzazione degli acidi nucleici:

  1. Serve sempre uno stampo → cioè un filamento di DNA da copiare.

  2. La catena di RNA cresce sempre da 5’(P) → 3’(OH), cioè aggiungendo nucleotidi all’estremità 3’-OH.

  3. Ogni nucleotide entra come ribonucleoside trifosfato (NTP):

     • uno dei fosfati serve a legarsi,

     • gli altri due vengono scissi come pirofosfato (PPi), che poi si idrolizza → la reazione diventa molto esoergonica e stabile.

Da ricordare: l’RNA polimerasi può iniziare la sintesi da zero (non serve un primer come nella replicazione).

Quali sono le regole generali della trascrizione e qual è la direzione di sintesi dell’RNA?

• La trascrizione funziona come la replicazione: serve un filamento di DNA stampo da copiare.

• L’RNA viene sintetizzato sempre da 5’ verso 3’: significa che i nucleotidi si aggiungono al gruppo -OH del carbonio 3’.

• I nucleotidi usati sono ribonucleosidi trifosfati (NTP).

  • Quando si legano, rilasciano un pirofosfato (PPi).

  • Questo pirofosfato si rompe in due fosfati → reazione molto energetica e stabile.

Punti chiave: serve un filamento stampo, la catena cresce 5’ → 3’, l’energia arriva dall’idrolisi dei NTP.

Quale filamento di DNA viene copiato durante la trascrizione e qual è la convenzione per scrivere i geni?

• Solo uno dei due filamenti di DNA viene copiato:

  • è il filamento stampo (detto anche antisenso), letto da 3’ a 5’.

  • L’altro filamento è il non stampo (detto anche senso) → non viene copiato, ma la sua sequenza è quasi identica all’RNA (stessa direzione 5’→3’, con la differenza che nell’RNA c’è U al posto di T).

• Per comodità, la sequenza dei geni si scrive sempre come la sequenza del filamento non stampo, perché corrisponde direttamente all’RNA che si produce.

• In alcuni casi speciali entrambi i filamenti possono essere usati (es. fago T4, gene GnRH nei vertebrati).

Che cos’è il promotore e qual è la direzione di lavoro della RNA polimerasi?

• Il promotore è una sequenza del DNA dove l’RNA polimerasi si lega per iniziare la trascrizione.

• L’RNA polimerasi legge il filamento stampo da 3’ a 5’, così può costruire un RNA da 5’ a 3’.

Punti chiave: il promotore indica dove e in che direzione iniziare la trascrizione.

Quanto è veloce la trascrizione rispetto alla replicazione nell’ E.coli?

• La trascrizione è molto più lenta: circa 10–15 volte più lenta della replicazione.

• I trascritti possono essere lunghi → l’RNA polimerasi deve restare legata stabilmente al DNA dall’inizio fino alla fine.

• Per questo, quando la replicazione e la trascrizione avvengono sullo stesso DNA, possono incontrarsi e “scontrarsi”.

Cosa accade se la DNA polimerasi incontra l’RNA polimerasi durante la trascrizione?

Possibili scenari:

1. La replicazione spinge via la trascrizione (RNA polimerasi eliminata).

2. La replicazione rallenta e segue la trascrizione.

3. La replicazione sorpassa la trascrizione senza distruggerla (scenario più vantaggioso).

➡ Nel terzo caso:

• La DNA polimerasi destabilizza un po’ l’ibrido DNA-RNA.

• Ma l’RNA nascente resta legato all’RNA polimerasi.

• L’RNA polimerasi rimane attaccata al DNA → appena la DNA polimerasi passa, la trascrizione riprende.

Esempio: nel gene Ubx di Drosophila la trascrizione può durare più della fase S, segno che la replicazione non distrugge il trascritto.

Punti chiave: la cellula preferisce non sprecare energia → la trascrizione riprende dopo il passaggio della replicazione.

Com’è fatta l’RNA polimerasi nei batteri?

• ’enzima si chiama apoenzima (core):

  • 2 subunità α

  • 1 subunità β

  • 1 subunità β’

• Per diventare attiva, si unisce una subunità σ → così forma l’oloenzima.

• Esiste anche una subunità ω, con funzione non del tutto chiara.

• La subunità σ è fondamentale:

  • permette il riconoscimento dei promotori (punti di inizio trascrizione).

  • senza σ l’enzima può allungare l’RNA, ma non può iniziare.

• Esistono diverse forme di σ → ognuna riconosce diversi promotori → permette di regolare quali geni vengono trascritti in base alle necessità della cellula.

Punti chiave: core = α2ββ’ + σ = inizio trascrizione.

Com’è fatto un promotore batterico e cosa sono le sequenze -35 e -10?

• Un promotore è una sequenza di DNA dove si lega la RNA polimerasi.

• Nei batteri ci sono due regioni principali:

  • Regione -35 (35 nucleotidi a monte del punto di inizio).

  • Regione -10 (10 nucleotidi a monte), chiamata anche Pribnow box.

• La Pribnow box è ricca di A e T → più facile da aprire (solo 2 legami H per coppia) rispetto a GC (3 legami H).

• La trascrizione inizia dal nucleotide +1.

• L’RNA polimerasi lavora 5’ → 3’.

Punti chiave: nei batteri il promotore è definito da due regioni (-35 e -10), fondamentali per l’avvio della trascrizione.

Come avviene la terminazione della trascrizione nei batteri?

A (retro):
Ci sono due tipi di terminazione:

1. ρ-indipendente (senza proteine):

   • Il DNA ha sequenze palindromiche → l’RNA trascritto forma un loop (ansa a forcina).

   • Seguito da molte basi G-C che rallentano la polimerasi.

   • Risultato: la polimerasi si stacca e l’RNA viene rilasciato.

2. ρ-dipendente (con proteina ρ):

   • ρ è una proteina con attività ATP-asica che si lega all’RNA nascente.

   • Viaggia lungo l’RNA e, approfittando dei rallentamenti della polimerasi, raggiunge il trascritto e stacca la polimerasi.

Punti chiave: terminazione può essere meccanica (loop) o con proteina ρ.

Come avviene la terminazione della trascrizione nei batteri?

A (retro):
Ci sono due tipi di terminazione:

1. ρ-indipendente (senza proteine):

   • Il DNA ha sequenze palindromiche → l’RNA trascritto forma un loop (ansa a forcina).

   • Seguito da molte basi G-C che rallentano la polimerasi.

   • Risultato: la polimerasi si stacca e l’RNA viene rilasciato.

2. ρ-dipendente (con proteina ρ):

   • ρ è una proteina con attività ATP-asica che si lega all’RNA nascente.

   • Viaggia lungo l’RNA e, approfittando dei rallentamenti della polimerasi, raggiunge il trascritto e stacca la polimerasi.

Punti chiave: terminazione può essere meccanica (loop) o con proteina ρ.

Come viene regolata la trascrizione nei batteri? E come funziona l’operone Lac in E. coli?

Regolazione della trascrizione nei batteri

• Avviene grazie a proteine regolatrici (CAP) che si legano al DNA o alla RNA polimerasi:

  • Attivatori: aumentano la trascrizione

  • Repressori: bloccano la trascrizione legandosi a operatori o promotori.

• l’operone lac è un gruppo di geni sul DNA batterico che codificano enzimi per usare il lattosio come fonte di zucchero. I principali geni sono:

  • lacZ → β-galattosidasi (scinde il lattosio),

  • lacY → permeasi (fa entrare il lattosio nella cellula),

  • lacA → transacetilasi (ruolo minore).

• Chi controlla la trascrizione:

  1. Repressore LacI (gene lacI): è prodotto costitutivamente e si lega all’operatore, bloccando l’RNA polimerasi quando non c’è lattosio.

     • Induttore = allolattosio (o analoghi): quando è presente lattosio, una molecola di lattosio viene convertita in allolattosio che si lega al repressore → il repressore cambia forma e si staccadall’operatore → la trascrizione può iniziare.

  2. Controllo positivo — CAP / cAMP:

     • Quando il glucosio è basso, aumenta cAMP → cAMP si lega a CAP → il complesso CAP–cAMP si lega vicino al promotore e aiuta l’RNA polimerasi a legarsi bene → trascrizione forte.

     • Se il glucosio è alto, cAMP è basso → CAP non si lega → anche se il repressore è staccato (lattosio presente), l’espressione resta debole.

• Regolazione combinata (logica): servono due condizioni per la massima trascrizione:

  1. Lattosio presente → il repressore è inattivo (induzione).

  2. Glucosio basso → CAP–cAMP attivo (attivazione).
     — Solo insieme si ha espressione massima.

Cosa sono gli mRNA policistronici e come si differenziano dai monocistronici?

• Un cistrone = tratto di DNA che codifica per una proteina.

• mRNA policistronico:

  • Contiene più cistroni → quindi più geni nello stesso mRNA.

  • Tipico dei procarioti.

  • Permette di coordinare la produzione di più proteine legate alla stessa funzione (es. enzimi di una stessa via metabolica).

• mRNA monocistronico:

  • Contiene un solo cistrone, quindi una sola proteina.

  • Tipico degli eucarioti.

Punti chiave: procarioti = policistronici, eucarioti = monocistronici.

Che cosa sono gli elementi regolativi in cis?

• Sono sequenze di DNA che regolano la trascrizione di un gene.

• Si chiamano “in cis” perché devono trovarsi sullo stesso filamento di DNA del gene che controllano (non funzionano se sono separati su un altro cromosoma).

• Non codificano proteine: la loro funzione è essere siti di legame per proteine regolatrici (attivatori, repressori, RNA polimerasi).

• Determinano quando, dove e quanto un gene viene espresso.

Che cos’è un promotore?

• È la sequenza di DNA dove si lega l’RNA polimerasi per iniziare la trascrizione.

• Contiene segnali specifici che indicano il punto di inizio (+1) e regolano l’efficienza della trascrizione.

• Negli eucarioti e nei procarioti i promotori hanno caratteristiche diverse:

  • Procarioti: contengono le regioni -10 (Pribnow box, ricca in A e T) e -35 → essenziali per il riconoscimento da parte della subunità σ della RNA polimerasi.

  • Eucarioti: promotore principale = TATA box (circa -25 nucleotidi dal sito +1), dove si lega la TBP (TATA binding protein), che aiuta l’assemblaggio della RNA polimerasi II.

Oltre al promotore, quali sono gli altri elementi regolativi in cis negli eucarioti?

• Enhancer (potenziatori):

  • Sequenze che aumentano l’efficienza della trascrizione.

  • Possono trovarsi molto lontano dal gene (anche migliaia di basi a monte o a valle).

  • Funzionano tramite il legame con attivatori → il DNA si ripiega, mettendo enhancer e promotore in contatto.

• Silencer (silenziatori):

  • Sequenze che diminuiscono la trascrizione.

  • Si legano a repressori che impediscono il reclutamento della polimerasi.

• Insulator (isolatori):

  • Barriere che impediscono l’azione di un enhancer su un gene vicino indesiderato.

Differenza tra elementi regolativi in cis e in trans?

• In cis = sequenze di DNA non mobili, legate fisicamente al gene che regolano (promotori, enhancer, silencer, operatori nei procarioti).

• In trans = proteine o RNA che si legano a questi elementi in cis (es. repressore LacI, fattori di trascrizione, attivatori).
  Un gene può essere regolato solo se entrambi i tipi (cis + trans) lavorano insieme.

Esempio pratico di elementi regolativi in cis nei procarioti?

Operone lac (E. coli):

• Promotore: dove si lega RNA polimerasi.

• Operatore: sequenza in cis dove si lega il repressore LacI → blocca la trascrizione.

• CAP binding site: sito a monte del promotore dove si lega CAP-cAMP (attivatore) quando il glucosio è basso.
  Tutti questi elementi in cis funzionano solo se presenti sullo stesso DNA dell’operone.

Come avviene la maturazione degli mRNA nei batteri?

• Gli mRNA batterici subiscono poche modificazioni rispetto a quelli eucariotici.

• La loro estremità 5′P è subito agganciata dai ribosomi → traduzione e trascrizione avvengono contemporaneamente(evento co-trascrizionale).

• Possibili modifiche:

  • Metilazioni di alcune basi.

  • In rari casi, aggiunta di una coda poli(A) (simile agli eucarioti).

  • Recentemente scoperto: se il primo nucleotide è adenina, può esserci un “capping” alternativo → al posto di A normale, la polimerasi può usare un nucleotide come il NAD⁺ → l’mRNA inizia con un cap di NAD⁺, che stabilizza la molecola (analogo al cap eucariotico).

Come avviene la maturazione degli rRNA nei batteri?

1. Tipi principali di rRNA batterici:

   • 16S rRNA → fa parte della subunità minore (30S) del ribosoma.

   • 23S rRNA → fa parte della subunità maggiore (50S).

   • 5S rRNA → anche questo nella subunità maggiore.
     Insieme, formano la struttura fondamentale dei ribosomi e quindi sono essenziali per la sintesi proteica.

2. Organizzazione genica in E. coli:

   • Ci sono 7 copie di sequenze di DNA (cluster) che contengono i geni per 16S, 23S, 5S rRNA.

   • Questi cluster includono anche alcuni geni per tRNA → quindi rRNA e tRNA sono trascritti insieme.

   • Ogni cluster ha due promotori (uno più a monte e uno più vicino) con sequenze simili a quelle degli mRNA → ciò permette un controllo fine della trascrizione.

3. Trascrizione:

   • Da ogni cluster si forma un lungo precursore di RNA che contiene:

     • le sequenze degli rRNA (16S, 23S, 5S),

     • le sequenze dei tRNA,

     • spaziatori (sequenze in mezzo che non servono).

4. Maturazione:

   • Questo precursore viene tagliato in punti precisi da enzimi chiamati endonucleasi RNasi.

   • Le RNasi rimuovono gli spaziatori e liberano le molecole mature di:

     • 16S rRNA,

     • 23S rRNA,

     • 5S rRNA,

     • e i tRNA inclusi.

Risultato: si ottengono le molecole rRNA maturi pronte per assemblare i ribosomi, più alcuni tRNA già funzionali.

Come maturano i tRNA nei batteri?

1. Origine dei tRNA:

   • I tRNA nei batteri non vengono prodotti singolarmente.

   • La maggior parte deriva da precursori lunghi di RNA che contengono più geni di tRNA insieme ad altri RNA (come rRNA).

   • Alcuni tRNA derivano anche da trascritti principalmente dedicati agli rRNA.

2. Struttura dei precursori:

   • Questi precursori contengono:

     • le sequenze per vari tRNA,

     • spaziatori (sequenze extra tra i tRNA),

     • talvolta anche rRNA.

   • I promotori che avviano la trascrizione di questi precursori sono simili a quelli degli mRNA.

3. Processo di maturazione:

   • Gli spaziatori vengono rimossi attraverso tagli precisi eseguiti da enzimi chiamati endonucleasi RNasi.

   • Il risultato è un tRNA già vicino alla forma finale.

4. Modificazioni particolari:

   • Tutti i tRNA batterici subiscono modifiche chimiche alle basi (nucleotidi), creando basi rare come:

     • ipoxantina,

     • diidrouracile,

     • timina.

   • Queste modifiche aiutano il tRNA a funzionare correttamente durante la traduzione.

5. Sequenza speciale 5'-CCA-3':

   • È una sequenza che caratterizza tutti i tRNA maturi e si trova all’estremità 3'.

   • Nei batteri (es. E. coli), questa sequenza è già trascritta nel gene del tRNA, quindi non serve aggiungerla dopo la trascrizione (a differenza di alcuni eucarioti).

6. Eccezione nei batteri speciali:

   • In archeobatteri e cianobatteri sono stati trovati introni nei geni dei tRNA.

   • Questi intron possono essere rimossi da un processo chiamato autosplicing → significa che il tRNA stesso contiene un “ribozima” capace di tagliarsi e unirsi da solo.

Esistono fenomeni di splicing nei batteri?

• In generale, gli mRNA batterici non hanno introni come negli eucarioti.

• Eccezioni: in archeobatteri e cianobatteri ci sono introni in alcuni RNA.

• Questi introni hanno capacità enzimatica propria (sono ribozimi) → fanno auto-splicing (si eliminano da soli dal precursore).

• Questo fenomeno è importante perché supporta l’ipotesi dell’RNA world (RNA come molecola antica con funzioni sia di deposito informativo che catalitiche).