Lecture 8 part 2: Vectors and strategies for plant recombination

Vektorsystem för växter

1) Vektorer baserade på naturligt förekommande plasmider av Agrobacterium tumefaciens.

2) Direkt genöverföring med olika typer av plasmid-DNA.

3) Vektorer baserade på växtvirus.

Agrobacterium tumefaciens

En jordbakterie som kan infektera växtsår och orsakar gallbildning på grund av snabb celldelning. Virulenta stammar har en stor tumörinducerande plasmid, Ti-plasmid. Kopieantal och insättningsposition är slumpmässiga. Uttrycket påverkas också av promotorn (vi kan designa).

Ti-plasmid (tumörinducerande)

I Agrobacterium tumefaciens. Har en T-DNA-region, allt mellan höger och vänster gräns kommer att sättas in i växten. Utanför T-DNA finns virulensregionen som inkluderar allt som behövs för överföring.

Infektion med agrobacterium tumefaciens

T-DNA-regionen från Ti-plasmid integreras i växtgenomet vilket leder till snabb celldelning och syntes av opiner (näringsämnen för bakterierna). Plasmiden har också en gen för att använda opinet.

Två sätt för att göra detta: 1) Binärvektorstrategin. 2) Samintegrationsstrategin.

The binary vector strategy (binärvektorstrategin)

• För överföring av genetiskt material med Ti-plasmid.

• En binär vektor och en hjälpplasmid introduceras i agrobacterium genom separata transformationer.

• Hjälpplasmiden tillhandahåller nödvändiga funktioner för att överföra T-DNA från vektor till växt under infektion.

• När bakterien infekterar överför den T-DNA-regionen från vektor till växtgenomet.

Co-integration strategy

• För överföring av genetiskt material med Ti-plasmid.

• Selektiv markör + gen av intresse klonas i separata plasmider och transformeras till Agrobacterium som samkultiveras med växtvävnad.

• Genom homolog rekombination samintegreras T-DNA-regionen från båda plasmiderna och överförs till växtgenomet under infektion. Selektion via markör

Förbereda Ti-plasmid för co-integration strategy

Ti-plasmiden sätts först in i E. coli, sedan Agrobacterium tumefaciens och slutligen växten. Det finns behov av selektionsmarkörer för alla tre arter/system och ORIs för E.coli och agrobacterium.

Exempel på selektionsmarkörer: antibiotika, herbicider, mannos eller fluorescens.

Plant transformation using Ti-plasmid

1. Inokulera med rekombinant A.tumefaciens.

2. Platta ut på fast medium där transformerad callus växer.

3. Överför till medium med tillväxthormoner där skott bildas.

4. Plantera till jord = transformerad växt.

   

• Vid DNA överföring från plasmid till cellen är positionen där den slutar slumpvis, vi kan inte kontrollera den.

Floral dipping

Används för genetisk transformation direkt i fröna, särskilt Aribidopsis thaliana. Nedsänkning av blomkluster i suspension av Agrobacterium som innehåller det önskade DNA-konstruktet. Stor fördel är att cellkultur inte behövs"!

Vacuum assisted floral dipping

Användning av vakuumtryck under nedsänkningen av växten i Agrobacterium-suspensionen, förstärker penetrationen och upptaget i växtcellerna. Används vid transformation av arter med tjockare blomvävnader eller begränsad tillgänglighet för transformation med traditionella metoder. Till exempel arten camelina sativa.

Particle bombardment (biolistics)

Alternativ genleveransmetod. Små guldpartiklar är belagda med plasmiderna och skjuts in i vävnaden. Används ofta för växtembryon.

Electroporation

Metod för genleverans. Högspänningspulser används för att skapa porer i cellmembranet vilket tillåter plasmiden att komma in i cellerna. Används om arten kan rekonstrueras från protoplaster eller enstaka celler. Används för celler utan väggar (protoplast eller djurceller). Nackdel: regeneration är svår.

Protoplast

Enstaka celler utan cellvägg. Cellvägg nedbruten med enzymer (cellulaser, pektinaser, xylanaser etc). Protoplaster är mycket känsliga för osmotisk stress. Avsaknad av cellvägg underlättar gen-, protein- och RNA-överföring. Hormoner för att återskapa cellväggen.

Callus

Är oorganiserade delvis odifferentierade cellmassor som används i levande växter för att täcka vävnadsskador. Skapas från protoplaster eller andra dedifferentierade celler, med hjälp av växthormoner. Används för transformation.

Regenerativa hormoner for callus

Auxin: rotstimulerande hormon. Cytokinin: skottstimulerande hormon.

Varför genmodifierade grödor?

Utökar genetiskt material, undviker negativa effekter från kopplade gener som kan uppstå vid korsning, nya egenskaper kan introduceras och oönskade egenskaper kan tas bort eller modifieras.

Man kan alltså få insektsresistenta eller herbicidresistenta grödor, grödor som producerar vitaminer och antocyaniner och kan skapa växter som biofabriker (producera läkemedel mm).

The δ-endotoxins of Bacillus thuringiensis

Används som skadedjursbekämpning. Bildar kristallina kroppar under sporulering som innehåller insekticidprotein δ-endotoxin som är en inaktiv prekursor. När det intas av insekter klyvs det av proteaser och blir giftigt, vilket leder till svält för skadedjuren.

Mekanismen för δ-endotoxinerna från Bacillus thuringiensis

δ-endotoxinet används som skadedjursbekämpning genom att introducera det via direkta metoder eller Agrobacterium i växter. Efter att ha intagits av insekter klyvs det av proteaser. Det binder till insidan av insekternas tarm och skadar ytepitelet. Insekten kan inte äta och svälter följaktligen till döds.

Insect resistance of δ-endotoxin, strategies

1. Gm-grödor som uttrycker två toxiner, svårare för resistensutveckling mot båda.

2. Konstruera toxinproduktion så att syntes endast sker i delar som behöver skydd.

3. Blanda GM-växter med icke-GM-växter.

Ogräshantering

1. Kulturellt genom: plantering av högkvalitativa frön på rätt djup, smal radplantering, växelbruk med perenner.

2. Mekanisk borttagning för hand eller med maskiner.

3. Kemiskt med herbicider. Problem kan vara att det angriper både ogräs och det man vill odla. Lösning kan vara att behandla jorden innan plantering.

Herbicide resistant crops developement

Utveckla transgena växter som är helt resistenta mot en specifik, bredspektrumherbicid. Välj en med minimal miljöpåverkan. Ger selektivitet i växtsystemet och antalet sprutningar kan minskas, vilket minskar mängden herbicid.

Effects of herbicide resistant crops

Mindre påverkan på jord, grundvatten, lägre insatskostnad och lägre energikostnad.

Glyphosate and plants

Glyfosat hämmar Shikimate-vägen som producerar aromatiska aminosyror i växter. Glyfosat påverkar EPSPS-genen indirekt genom att hämma aktiviteten hos EPSPS-enzymet vilket leder till växtdöd. Denna väg finns inte hos djur, alltså tolererar dem glyfosat.

Strategier för att skapa glyfosatresistenta grödor

• Introduktion av resistant EPSP. Skapas genom att införa glyfosatresistenta EPSP-gener i grödor, t.ex. från Agrobacterium. Gör att de tolererar 3 ggr högre mängd glyfosat än som normalt används. Nackdel är att glyfosatet ackumuleras i växten.

• Introduktion av gen som degraderar glyfosat (GLYAT). Vissa bakterier har enzymet GLYAT som avgiftar glyfosat genom att fästa en acetylgrupp till det. Man kan använda riktad evolution för att producera ett högaktivt GLYAT-enzym, som har en 10000 ggr högre enzymaktivitet. Detta tolererar 6 ggr mer glyfosat än som normalt används.

  

Biofortification (bioförstärkning)

Bioförstärkning är processen att förbättra den näringsmässiga kvaliteten på matgrödor. Används till exempel för gyllene ris och antocyaninrika livsmedel

Golden rice

Genetiskt modifierad risvariant som har utvecklats för att åtgärda vitamin A-brist. Den har en förstärkt gyllengul färg på grund av de ökade nivåerna av betakaroten, en prekursor till vitamin A. Utvecklingen involverade introduktionen av tre gener i risgenomet.

Anthocyanin-rich foods

Antocyanin är ett pigment som är ansvarigt för den röd/lila/blå färgen i många frukter och grönsaker som har antioxidant- och antiinflammatoriska egenskaper, exempelvis tomater. Bioförstärkning kan öka koncentrationen av antocyanin för att ge förbättrade hälsofördelar.

Model plant species

Arter som har fungerat som värdefulla verktyg inom växtforskning och har bidragit avsevärt till vår förståelse för olika aspekter av växtbiologi, genetik och bioteknik. Ex: arabidopsis thaliana, brachypodium, nicotiana och camelina sativa.

Arabidopsis thaliana

Första växtmodellen. Har litet genom, kort livscykel, liten växt och är lätt transformerbar. Tidiga knockout-bibliotek med T-DNA, den tidiga åtkomsten har hjälpt till att bestämma funktioner hos många gener.

Brachypodium

Monokot modellgräs. C3-växt spridd över hela världen. Har ett litet genom, kort livscykel, liten växt och är lämplig för genetisk transformation.

Nicotiana

Modellart. Transient uttryck och proteinproduktion. Metoder för nya växtförädlingstekniker via denna art.

Camelina sativa

Modellväxt som används för växtbioteknik. Speciellt lipider.

​​Tobacco leaf agroinfiltration

Används för att inducera transient uttryck genom att införa främmande genetiskt material. Leverans av gener eller genetiska konstruktioner till celler i tobaksblad. Används ofta för att studera genfunktion, proteinproduktion och bedöma genuttrycksnivåer.

Tobacco leaf agroinfiltration usages

För att inducera transient uttryck. Test: andra system än agrobacterium, plasmider (om uttrycket fungerar), proteinproduktion (genom att skörda blad och rena proteiner). Enzymtestning: vilka är produkterna (via MS), och tillsätt substrat/plasmid som producerar substrat. Testa transkriptionsfaktorer, deras effektivitet och målgener med hjälp av RNA-seq för att undersöka uttrycksförändringar.

Original Ti plasmid

• Har en vänstergräns och en högergräns

• Allt mellan gränssekvenserna överförs

• Virulensregionen behövs för att överföringen ska ske

• Auxin och cytokinin – växthormoner – inducerar tillväxt

• Opiner – aminosyraderivat, används som näringskälla för Agrobacterium

• Allt vi vill tillsätta i vår växt läggs i T-DNA-regionen

Fettväxtgrödor med ändrad fettsyresammansättning

• Exempelvis har man infört gener för fettsyradesaturaser, som ändrar typen av fettsyror som produceras.

• Detta kan förbättra näringsvärdet eller ge tekniskt bättre oljor (ex. för industriell användning).

Spannmål med ökat lysininnehåll

• Spannmål (som vete, majs) har normalt lågt innehåll av aminosyran lysin, som är essentiell för människor.

• Genom att införa en ärtprotein-gen, har man höjt lysininnehållet, vilket gör spannmålet mer näringsrikt.