ROZDZIAŁ BIAŁEK (ELEKTROFOREZA SDS-PAGE I SĄCZENIE MOLEKULARNE)

Czym jest elektroforeza?

Zjawisko poruszania się cząstki, które jest obdarzona ładunkiem elektrycznym, w polu elektrycznym

Co możemy rozdzielić za pomocą elektroforezy?

• Białka

• RNA i DNA

• Aminokwasy

Dlaczego rozdział tych związków jest możliwy?

Szybkość przemieszczania się cząsteczki jest proporcjonalna do natężenia pola elektrycznego i wypadkowego jej ładunku, a odwrotnie proporcjonalna do współczynnika tarcia

Co ma wpływ na kierunek migracji?

Znak jonu

Co ma wpływ na tempo migracji?

• wielkość ładunku 

• wielkość i kształt cząsteczki

Co wykorzystuje się do rozdzielania podobnych do siebie cząstek (np. białka i kwasy nukleinowe)?

Żel utrudniający migrację, dzięki uwypukleniu różnic w rozmiarze i kształcie

Co stosujemy najczęściej do rozdziału białek?

Elektroforezę w żelu agarozowym (SDS-PAGE)

Z czego składa się żel agarozowy?

• akrylamid

  • N,N’metylenobisakrylamid

Co się dzieje w metodzie SDS-PAGE?

Białko poddaje się denaturacji i tworzy się kompleksy z ujemnym ładunkiem

Od czego zależy tempo migracji w SDS-PAGE?

Od wielkości cząsteczki

Co wchodzi w skład buforu Laemllie’go?

• woda

• glicerol

• Tris

• Dodecylosiarczan sodu (SDS)

• 2-merkaptoetanol

• błękit bromofenolowy

Jaka jest funkcja Tris w buforze Laemmli’ego?

Buforowanie roztworu (gdy pH 6,8 → używamy HCl) (gdy 8,3 → używamy glicyny)

Jaka jest funkcja glicerolu w buforze Laemmli’ego?

Obciążanie próbki w kieszonce

Jaka jest funkcja dodecylosiarczanu sodu w buforze Laemmli’ego?

• denaturacja białek

• opłaszczanie

• nadanie ujemnego ładunku

• zapobiega wytrącaniu się biała → zostaje rozpuszczone

Jaka jest funkcja 2-merkaptoetanolu w buforze Laemmli’ego?

• zerwanie mostków disiarczkowych (dzięki posiadaniu grupy -SH)

Jaka jest funkcja błękit bromofenolowy w buforze Laemmli’ego?

• monitorowanie postępu elektroforezy

• wyznacza koniec elektroforezy

Czego używamy do uwidocznienia białek?

błękit brylantowy Coomassie R-250

Jaką barwę będą miały kompleksy białko-błękit brylantowy?

Niebieski

Czym jest dyfuzja?

Samorzutne rozprzestrzenienie się

Dlaczego mierzymy absorpcję przy 280nm?

Jest to maksimum absorpcji dla białek z pierścieniami aromatycznymi (tyrozyny i tryptofanu)