Flashcards week 2 - biotechnologie

Wat is het algemene principe van recombinant-eiwitproductie?

Je geeft een cel via recombinant DNA de genetische instructies om een gewenst eiwit te produceren, bijvoorbeeld een therapeutisch eiwit

Welke vier hoofdstappen zijn er bij de productie van een recombinant eiwit?

1. Cloning/recombinant DNA

2. Eiwitproductie

3. Zuivering

4. Formulering en opslag

Wat bepaal je bij het opstellen van een cloningstrategie?

Welk gen nodig is, hoe je het gen verkrijgt, in welke vector je het plaatst en in welke productiecel/host je de vector brengt

Waarom is de keuze van de productiecel belangrijk?

Verschillende cellen kunnen een geproduceerd eiwit anders verwerken en modificeren. Dit kan invloed hebben op de stabiliteit en functie van het uiteindelijke eiwit.

Welke eigenschappen moet het uiteindelijke geproduceerde eiwit hebben?

De juiste aminozuursequentie, stereochemie/3D-structuur, correcte vouwing en kwaliteit en benodigde posttranslationele modificaties. Eventueel kunnen ook tags aanwezig zijn.

Welke cellen kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt voor recombinant-eiwitproductie?

Bacteriën of eukaryote cellen

Wat is de functie van de vector?

De vector draagt het gewenste gen en maakt het mogelijk dit DNA in een geschikte gastheercel te brengen en daar te laten gebruiken

Wat is recombinant DNA?

DNA dat kunstmatig is samengesteld door DNA-sequenties te combineren, bijv. door een menselijk gen in een plasmide/vector te plaatsen

Wat is een belangrijk verschil tussen eiwitproductie in bacteriën en eukaryote cellen?

Een belangrijk verschil zit in de posttranslationele modificaties. Eukaryote cellen kunnen complexe modificaties uitvoeren die bacteriën niet of anders uitvoeren

Wat is glycosylering?

Een posttranslationele modificatie waarbij suikerketens aan een eiwit worden gekoppeld

Wat gebeurt er nadat het recombinant DNA in de productiecel is gebracht?

De cel gebruikt het ingebrachte gen als instructie om het gewenste eiwit te produceren via transcriptie en translatie

Wat zijn posttranslationele modificaties?

Veranderingen die aan een eiwit worden aangebracht nadat het eiwit is gemaakt en die belangrijk kunnen zijn voor de structuur, stabiliteit en functie van het eiwit

Waarom kan glycosylering belangrijk zijn voor therapeutische eiwitten?

De juiste suikerketens kunnen belangrijk zijn voor de vouwing, stabiliteit, activiteit en levensduur/circulatietijd van een eiwit in het lichaam

Waarom zijn bacteriën niet altijd geschikt voor het produceren van menselijke therapeutische eiwitten?

Bacteriën kunnen niet dezelfde complexe menselijke posttranslationele modificaties, zoals bepaalde vormen van glycosylering, uitvoeren. Het geproduceerde eiwit kan daardoor andere eigenschappen hebben

Je wilt een therapeutisch antilichaam produceren. Waarom zou je eerder een geschikte eukaryote cel dan een bacterie gebruiken?

Een antilichaam heeft belangrijke posttranslationele modificaties (glycosylering) nodig. Bacteriën kunnen niet dezelfde complexe glycosylering uitvoeren als eukaryote cellen. Verkeerde of ontbrekende glycosylering kan de stabiliteit, functie en circulatietijd van het antilichaam beïnvloeden

Waarom moet een recombinant eiwit na productie worden gezuiverd?

Om het gewenste eiwit te scheiden van gastheercel-eiwitten, celresten en andere verontreinigingen

Wat is het doel van de zuiveringsstap?

Het gewenste eiwit zo zuiver mogelijk isoleren en ongewenste eiwitten en andere verontreinigingen verwijderen

Waarom kun je het geproduceerde mengsel niet direct als geneesmiddel gebruiken?

Omdat het naast het gewenste eiwit veel andere eiwitten en celbestanddelen bevat die niet in het uiteindelijke geneesmiddel thuishoren

Wat gebeurt er na de zuivering van het therapeutische eiwit?

Het gezuiverde eiwit wordt geformuleerd tot een geschikt eindproduct en vervolgens onder geschikte omstandigheden opgeslagen

Waarom is formulering belangrijk?

De formulering moet ervoor zorgen dat het eiwit gedurende langere tijd stabiel blijft en zijn juiste structuur en werking behoudt

Waarom is stabiliteit bij therapeutische eiwitten belangrijk?

Eiwitten kunnen bijvoorbeeld ontvouwen, aggregeren of afbreken, waardoor hun werkzaamheid en kwaliteit kunnen afnemen

Beschrijf stap voor stap hoe cellen kunnen worden gebruikt om een therapeutisch recombinant eiwit te produceren

1. Cloningstrategie: kies het gewenste gen, geschikte vector en geschikte productiecel

2. Recombinant DNA maken: plaats gewenste gen in de vector en breng deze in de productiecel

3. Eiwitproductie: cel leest gen af en produceert het eiwit. De keuze van de cel bepaalt mede welke posttranslationele modificaties kunnen plaatsvinden

4. Zuivering: isoleer het gewenste eiwit van duizenden andere eiwitten en bestandsdelen van de cel

5. Formulering en opslag: breng het eiwit in een geschikte formulering zodat het stabiel blijft tijdens opslag en gebruik

Waar begint de synthese van eiwitten in een eukaryote cel?

Op ribosomen in het cytosol

Wat gebeurt er met eiwitten die geen specifiek transportsignaal hebben?

Veel van deze eiwitten blijven in het cytosol. Andere bestemmingen kunnen eigen sorteersignalen vereisen

Welke route volgen eiwitten die door de cel uitgescheiden moeten worden?

Cytosol/ribosoom —> ruw ER —> golgi —> secretory vesicle —> celmembraan —> buiten de cel

Hoe weet een cel waar een nieuw eiwit naartoe moet?

Door signaalsequenties/signaalpeptiden in de aminozuursequentie van het eiwit

Wat is een signaalpeptide?

Een korte aminozuursequentie in een eiwit die als een soort adreslabel werkt en helpt bepalen waar het eiwit naartoe wordt getransporteerd

Beschrijf stap voor stap hoe een eiwit naar het ER wordt getransporteerd

1. Ribosoom bindt aan het mRNA en begint het eiwit te maken. Het groeiende eiwit komt uit het ribosoom

2. In het groeiende eiwit bevindt zicht een ER-signaalsequentie/signaalpeptide die aangeeft dat het eiwit naar het ER moet

3. Het signal recognition particle (SRP) herkent en bindt aan de ER-signaalsequentie van het groeiende eiwit, waardoor translatie tijdelijk gepauzeerd wordt zonder dat het ribosoom naar het ER kan worden gebracht

4. SRP brengt het ribosoom, mRNA en groeiende eiwit naar het membraan van het ER. Daar bindt de SRP aan de SRP-receptor in het ER-membraan

5. Het ribosoom wordt gekoppeld aan een translocatiekanaal (kanaal door membraan van ER). SRP laat los en wordt gerecycled

6. Het ribosoom gaat verder met maken eiwit. Terwijl het eiwit wordt gemaakt, wordt de groeiende polypeptideketen via het translocatiekanaal het ER-lumen in geleid (=co-translationele translocatie)

7. In het ER kan oa. eiwitvouwing, posttranslationele modificaties en verdere voorbereiding voor transport plaatsvinden. Daarna kan het eiwit via transportvesikels naar het Golgi-apparaat

Waarom is eiwitvouwing belangrijk?

Een eiwit moet de juiste 3D-structuur krijgen om goed te kunnen functioneren

Wat bepaalt voor een groot deel hoe een eiwit zich vouwt?

De aminozuurvolgorde en eigenschappen van de aminozuren, zoals lading en hydrofobiciteit

Welke vier niveaus van eiwitstructuur zijn er?

Primaire —> secundaire —> tertiaire —> quaternaire structuur.

Waarom is de primaire structuur belangrijk voor de uiteindelijke vouwing?

De aminozuurvolgorde bepaalt welke chemische interacties kunnen ontstaan en daarmee voor een groot deel hoe het eiwit zich vouwt

Wat is de secundaire structuur van een eiwit?

Lokale vouwing van de polypeptideketen tot structuren zoals een α-helix of β-sheet

Wat is een α-helix?

Een deel van de polypeptideketen dat zich oprolt tot een spiraalvormige structuur

Wat is een β-sheet?

Een structuur waarbij delen van de polypeptideketen naast elkaar liggen en samen een gevouwen plaat vormen

Welke interacties kunnen de tertiaire structuur stabiliseren?

Onder andere waterstofbruggen, ionische interacties, hydrofobe interacties en disulfidebruggen

Waarom is de tertiaire structuur belangrijk voor de functie van een eiwit?

De 3D-vorm bepaalt bijvoorbeeld de vorm van bindingsplaatsen en actieve centra en is daardoor essentieel voor de functie

Welke interacties kunnen de quaternaire structuur bij elkaar houden?

Vooral verschillende niet-covalente interacties, zoals hydrofobe interacties, waterstofbruggen en ionische interacties. In sommige eiwitten kunnen ook covalente disulfidebruggen tussen subunits voorkomen

Heeft ieder eiwit een quaternaire structuur?

Nee, alleen eiwitten die uit meerdere polypeptideketens/subunits bestaan hebben een quaternaire structuur

Welke omgevingsfactoren kunnen de structuur van een eiwit beïnvloeden?

Temperatuur en pH

Waarom kunnen veranderingen in temperatuur of pH een eiwit inactief maken?

Ze kunnen de interacties die de 3D-structuur stabiliseren verstoren, waardoor het eiwit zijn juiste vorm en functie verliest

Wat is de functie van disulfidebruggen in eiwitten?

Disulfidebruggen zijn sterke covalente verbindingen tussen cysteïnes die de gevouwen structuur van bepaalde eiwitten helpen stabiliseren

Wat is glycosylering?

Een posttranslationele modificatie waarbij suikerketens aan een eiwit worden toegevoegd. Dit kan invloed hebben op vouwing, stabiliteit en functie

Waarom worden sommige eiwitten eerst als inactief pro-eiwit gemaakt?

Sommige eiwitten kunnen schadelijk zijn voor cellen als ze op de verkeerde plaats of het verkeerde moment actief zijn

Hoe kan een pro-eiwit worden geactiveerd?

Door proteolytische cleavage. Een protease knipt een specifiek gedeelte van het eiwit af, waardoor het eiwit actief kan worden

Wat is een protease?

Een enzym dat peptidebindingen in eiwitten knipt

Wat zijn posttranslationele modificaties?

Veranderingen die aan een eiwit worden aangebracht nadat of terwijl de aminozuurketen wordt gemaakt. Hierdoor kan de structuur, stabiliteit, locatie of functie van het eiwit veranderen

Noem vier voorbeelden van posttranslationele modificaties.

Bijvoorbeeld glycosylering, fosforylering, acetylering en methylering

Wat is N-glycosylering?

Een vorm van glycosylering waarbij een suikerketen wordt gekoppeld aan het stikstofatoom van het aminozuur asparagine (Asn)

Waar begint N-glycosylering?

In het endoplasmatisch reticulum (ER).

Wat gebeurt er bij N-glycosylering met de suikerketen?

De suikerketen wordt tijdens het transport door het ER en Golgi-apparaat steeds verder aangepast.

Waarom worden complexe therapeutische eiwitten die afhankelijk zijn van glycosylering vaak in eukaryote cellen geproduceerd?

Eukaryote cellen hebben een ER en Golgi-apparaat en kunnen daardoor eiwitten goed glycosyleren. Bacteriën kunnen dit niet op dezelfde manier

Leg glycosylering uit.

Bij glycosylering worden suikerketens aan een eiwit gekoppeld. Bij N-glycosylering gebeurt dit aan asparagine en wordt de suikerketen verder aangepast in het ER en Golgi. De uiteindelijke structuur kan belangrijk zijn voor de vouwing, stabiliteit, functie en circulatietijd van het eiwit

Leg uit wat een disulfidebrug is en waarom deze belangrijk is.

Een disulfidebrug is een covalente binding tussen twee cysteïnes. Deze binding helpt de 3D-structuur van het eiwit te stabiliseren

Kan één mRNA-molecuul meerdere eiwitten produceren?

Ja, hetzelfde mRNA kan meerdere keren door ribosomen worden afgelezen, waardoor meerdere kopieën van een eiwit kunnen worden gemaakt

Wat heeft de stabiliteit van mRNA te maken met de hoeveelheid eiwit die wordt gemaakt?

Hoe langer een mRNA intact blijft, hoe vaker het door ribosomen kan worden afgelezen. Een stabieler mRNA kan daardoor vaak tot meer eiwitproductie leiden

Waar vinden transcriptie en translatie plaats bij eukaryoten?

Transcriptie en RNA processing vindt plaats in de celkern. Translatie vindt plaats in het cytoplasma

Waar vinden transcriptie en translatie plaats bij prokaryoten?

Beide vinden plaats in het cytoplasma

Wat is codon bias?

Codon bias betekent dat verschillende organismen bepaalde codons vaker gebruiken dan andere codons, ook al coderen die codons voor hetzelfde aminozuur

Hoe zie je in de afbeelding dat E. coli voor fenylalanine (F) een voorkeur heeft voor UUU boven UUC?

UUU heeft een hogere frequentie (0.57) dan UUC (0.43) dus dat betekent dat UUU vaker wordt gebruikt door E. coli

Waarom is codon bias belangrijk als je een menselijk eiwit in E. coli wilt produceren?

E. coli gebruikt sommige codons minder vaak dan menselijke cellen. Voor zeldzame codons zijn minder passende tRNA’s beschikbaar. Het ribosoom moet dan langer wachten op het juiste tRNA, waardoor de eiwitproductie langzamer en minder efficient kan worden

Wat heeft tRNA met codon bias te maken?

tRNA brengt het juiste aminozuur naar het ribosoom. Voor veelgebruikte codons zijn vaak meer passende tRNA's beschikbaar dan voor zeldzame codons

Wat gebeurt er als een gen veel codons bevat die E. coli weinig gebruikt?

Voor zeldzame codons zijn minder passende tRNA’s beschikbaar. Het ribosoom moet langer wachten op het juiste tRNA, waardoor de translatie langzamer verloopt en er minder efficient eiwit wordt geproduceerd

Wat is codonoptimalisatie?

Bij codonoptimalisatie vervang je zeldzame codons door codons die de productiecel vaker gebruikt. Beide codons coderen voor hetzelfde aminozuur dus het eiwit blijft hetzelfde, maar kan efficiënter worden geproduceerd.

Benoem verschillen tussen prokaryote en eukaryote eiwitproductie

Bij prokaryoten vinden transcriptie en translatie plaats in het cytoplasma. Bij eukaryoten vindt transcriptie plaats in de celkern. Het mRNA wordt daarna bewerkt door 5’-capping, poly-A-staart en splicing en daarna gaat het mRNA naar het cytoplasma voor translatie. Ze kunnen ook complexere modificaties (glycosylering) uitvoeren

Wat is een plasmide/vector?

Een plasmide is een klein, cirkelvormig stukje DNA dat los ligt in de cel van bacteriën en sommige andere eencellige organismen

Welke belangrijke onderdelen bevat een plasmide dat gebruikt wordt voor eiwitproductie?

Een ORI, een gen van interesse, een passende promotor, een terminatiesignaal en een selectiemarker (bijv. antibioticaresistentie)

Wat is een ORI?

Een ORI (Origin of Replication) is een specifieke DNA-sequentie waar de replicatie van het plasmide begint

Wat is de functie van een ORI?

De ORI zorgt ervoor dat het plasmide door de bacterie gekopieerd en daardoor vermeerderd kan worden

Wat gebeurt er als je de ORI uit een plasmide verwijdert?

Het plasmide kan niet goed meer worden gekopieerd en zal bij celdelingen uiteindelijk verloren gaan

Wat is het verschil tussen een plasmide en een vector?

Een plasmide is een klein circulair DNA-molecuul. Een vector is een drager waarmee je genetische informatie een cel inbrengt. Een plasmide kan als vector worden gebruikt

Waarom moet de promotor passen bij de gastheercel?

De gastheercel moet de promotor kunnen herkennen, zodat transcriptie van het gen kan beginnen

Waarom bevat een plasmide een antibioticaresistentiegen?

Het resistentiegen zit op het plasmide. Bacteriën die het plasmide hebben opgenomen, zijn daardoor resistent tegen het antibioticum en overleven. Bacteriën zonder plasmide gaan dood

Waarom helpt antibiotica om het plasmide in de bacteriën te behouden?

Een plasmide kost de bacterie energie. Zonder selectiedruk kunnen bacteriën het plasmide verliezen. Met antibioticum hebben bacteriën met het plasmide een selectievoordeel

Welke twee onderdelen zijn belangrijk om een plasmide in bacteriën te vermeerderen?

De ORI zorgt dat het plasmide wordt gekopieerd en de antibioticaresistentiemarker maakt het mogelijk bacteriën met het plasmide te selecteren

Wat is een MCS (multiple cloning site)?

Een MCS is een kort stuk DNA met meerdere restrictieplaatsen, waarin je een gewenst gen kunt plaatsen

Waarom zitten er meerdere restrictieplaatsen in een MCS?

Zodat je uit verschillende restrictie-enzymen kunt kiezen om het plasmide open te knippen en een gen erin te plaatsen

Waarom worden bacteriën gebruikt bij de eerste stap, het kloneren van recombinant DNA?

Bacteriën kunnen het plasmide snel vermeerderen, waardoor je veel kopieën van het recombinant DNA krijgt