8. Genové mutace, fyzikální a chemické mutageny.

Mutace

jakákoliv dědičná změna v genetickém materiálu, jejíž příčinou není segregace nebo genetická rekombinace, a která při přenosu do dceřiných buněk a následujících generací dává vznik mutantním buňkám nebo mutantním jedincům

nebo mutace: proces, kterým vznikají změny v sekvenci DNA, které ovlivňují fenotyp…na úrovní genů, chromozomů…

Mutant

organizmus, který má v důsledku mutace změněný genotyp

důsledek mutace

důsledek - vznik nové vzácné alely, jejichž frekvence je nižší než 1 %

Polymorfismus -

- stav, kdy vedle sebe společně existuje dvě či více forem určitého druhu

Polymorphism – any sequence variant present at a frequency of 1 % or higher in a population, whether or not it has functional consequences

Mutace a evoluce

• mutace jsou hlavním zdrojem veškeré genetické variability, diversity genomu, evoluční novinky…

• mutace poskytují prvotní materiál pro evoluci (adaptace, selekce…)

• rekombinace – přerozdělení - nové kombinace alel…

Historie studia mutací

Hugo de Vries (1901 – Die Mutationstheorie)

Hermann Muller – 1927 radiační mutageneze

Hermann J. Muller

The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1946

L. Stadler – radiační mutageneze u ječmene

Ch. Auerbachová – 1942 chemická mutageneze

(yperit) C4H8Cl2S – zpuchýřující bojový plyn (alkylační látka)

mutace pozitivní –

zdroj dědičné variability, geneticky podložené rozrůznění organismu s původně totožnými genotypy – selekce jedinců s výhodnými znaky, význam pro evoluci …..

Mutace negativní –

– změny v DNA, hromadění vadných genů, stárnutí, vznik geneticky podmíněných onemocnění, tvorba nádorů ……mutační nálož !

Mutace neutrální

Nemají vliv na fenotyp…

sekvenční varianta

– změna na úrovni sekvence DNA…

• genom člověka - 6 miliard pb ve 46 chromozomech…

• 2 jedinci se liší průměrně v 1 / z 1000 bazí – SNP

(polymorfismus založený na jediném nukleotidu)

• tj. asi ve 4-5 milionech pb !!! (0,1 % lidského genomu)

• i 1 sekvenční varianta může způsobit chorobu !

Bodová mutace

vzácná sekvenční varianta ovlivňující fenotyp!!!

Sekvenční varianta může být

patogenní x benigní x nejasného významu

typy mutací

spontánní x indukované

• gametické x somatické

• dominantní x recesivní

• přímé x zpětné

• de novo x zděděné

FENOTYPOVÉ ÚČINKY…

• morfologické mutace

• biochemické

• letální, pololetální, subvitální

• podmíněné (např. auxotrofní –

biochemické ztrátové mutace či teplotně

senzitivní mutace)

Gametické mutace

vznikají v gametách či v zárodečných tkáních ze kterých se diferencují pohlavní buňky…

může vzniknout nejen v gametě, ale i v primordiální línii zárodečných buněk – mutace ve více gametách germinální mozaicismus

Somatické mutace

vznikají v somatických buňkách organizmu

Dominatní gametická mutace

projeví se v potomstvu bezprostředně ….Aa

Recesivní mutace

(skryta u heterozygotů)

• projeví se jen v homozygotní sestavě….aa

• projeví se v hemizygotní sestavě u jedinců s

heterogametickou sestavou pohlavních chromozomů….XaY

• projeví se u haploidních organizmů

• častější (poměr dominantní recesivní 1 : 100)

je většina mutací recesivní nebo dominantní?

Většina mutací je recesivní povahy Mutace dominantní a recesivní poměr 1 : 100 (A a)

X-vázané recesivně letální mutace

mutace v genech potřebných pro růst a vývoj organizmu – (l) letální u samečků XY !

Amesův test

• využívá se při testování mutagenů a karcinogenů !

• bakterie testovacího kmene hisnerostou na půdě bez histidinu

• mutagen vyvolá zpětnou mutaci his- his+

• bakterie vyrostou na minimální půdě bez histidinu • testovaná látka je mutagen, který indukuje genové mutace !

Reverze

obnovení původního fenotypu Mutace přímá a zpětná

1. Reverze zpětnou mutací

AA → Aa přímá mutace

AA ↼ Aa zpětná mutace

Reverze supresorovou mutací

obnovení fenotypu další mutací !

rozlišení typů reverzí

Rozlišení pomocí zpětného křížení s jedincem se standardním fenotypem ! (str. 352), zpětná mutace – standardní fenotyp

syntetická teorie evoluce

Mutační a adaptační hypotéza 1937 – 1950: syntetická teorie evoluce – předpoklad náhodného vzniku mutací

Praktické ověření syntetická teorie evoluce

uria a Delbruck (1943) a) fluktuační test - bakterie citlivé k bakteriofágu T1, počet kolonií na misce obsahující bakteriofága (rezistentní bakterie – velká fluktuace kolonií) Lederberg a Lederberg (1952) b) razítkovací metoda

razítkovací metoda

Rezistence bakterie E. coli ke streptomycinu (mutace) rozředění bakterií – každá vytvořila kolonii…

Použitím razítkovací metody Lederbergrovi prokázali existenci mutantů rezistentních k streptomycinu v populaci baktérii ještě před tím, než došlo k působení antibiotika

Mutace vznikají spontánně (náhodně) ! a jednici s preexistujícími, náhodně vzniklými vzácnými mutacemi jsou podmínkami vnějšího prostředí selektováni

Epimutace

jakékoliv změny ve fenotypu, které nejsou důsledkem změny sekvencí DNA. Tyto změny mohou být stabilní a dědičné a zahrnují změny v metylaci DNA, kontrole transkripce a translace a postranslačních modifikace

Epigenetické procesy

lze definovat jako modulace genové exprese prostřednictvím mechanismů, které jsou nadřazeny dané primární sekvenci –

např. odlišná exprese různých kopií stejného genu (alel) – dvě alely někdy i se shodnou primární genetickou informací se dědí do potomstva v odlišných stavech

Genová mutace

změny v kódující sekvenci DNA asociované s určitým fenotypem nebo vyplývající z poškození či změny funkce

mutace v kódující oblasti

většinou způsobí patologii, podle toho, k jaké změně došlo

nekódující oblasti —

většinou se neprojeví a jedná se o tzv. tiché mutace (výjimky např. mutace sestřihu…)

Bodové (genové) mutace a jejich podstata

standardní alela → standardní protein (polypeptid)

mutantní alela → změněný protein / protein se netvoří

Bodové (genové) mutace a jejich molekulární podstata

Změna nukleotidové sekvence:

A - substituce (záměna) bází

B – delece, inzerce bází (mutace způsobující změnu čtecího rámce = posunové mutace)

Malé inzerce a delece = indels (1 – 50 bp) !!!

důsledky mutace

a) měnící smysl kodonu (jiná AMK) - missense

b) nesmyslné (stop kodon) - nonsense

c) tichá (silent, neutrální) mutace – jiný kodon, ale stejná AMK…

Vliv mutací na funkci proteinu

A) Nulimorfní mutace

B) Hypomorfní

C) Zisk nových vlastností

Nulimorfní mutace

žádný funkční protein (ztráta funkce) - recesivní

Hypomorfní –

– částečná funkce proteinu (neúplná dominance)

Zisk nových vlastností

proteinu (gain of function) – dominantní i recesivní

Recesivní mutace

mutace ztráty funkce (nulové alely) - jediná funkční alela je schopna zajistit dostatek funkčního proteinu) – viz enzymopatie – zablokování metabolických drah

• Všechny patofyziologické důsledky enzymopatií mohou být připsány akumulaci substrátu či nedostatku produktu

• Poruchy metabolismu aminokyselin, cukrů, lipidů, purínů, pyrimidínů aj.)

Dominantní mutace

haploinsuficience – mutace ztráty genů v jediné alele má přímý patologický dominantní efekt – např. mutace genů kódujících proteiny ve velkém množství tvořící součást velkých makromolekulárních struktur (kolagen I, globiny), regulační proteiny – poloviční ztráta normální aktivity proteinu způsobí chorobu

Zisk nové funkce - dominantně negativní mutace – syntetizován abnormální protein interferující s normální alelou

íklady recesivních mutací ovlivňujících metabolizmus

Blokády metabolických drah

• hromadění metabolitu, chybění produktu

fenylketonurie, albinismus, alkaptonurie, tyrozinaza

Fenylketonurie

způsobena mutací enzymu fenylalanin hydroxylazy …dieta…bez fenylalaninu !!!!

Albinizmus

způsoben mutací tyrozinázy

Alkaptonurie

způsobena mutací oxidazy kyseliny homogentisové

Tyrozinoza

- způsobena mutací tyrozin transaminazy

Dominantně negativní mutace

mutace v jediné alele kompletně vyřadí druhou alelu a tím i příslušnou biologickou funkci

často přítomny u proteinů tvořených z homopolymerů (dimery, trimery, tetramery) - např. mutace kolagenu u Osteogenesis imperfekta

Substituce 1 nukleotidu

nejčastější typ patologické mutace u člověka Příklad substituce - srpkovitá anemie – AR

Patogeneze srpkovité anémie

Mutace HbS - snížená rozpustnost odkysličeného hemoglobinu – deformace erytrocytů (anémie, zvětšená slezina, opakované infekce, otoky končetin…) Léčba - alogenní transplantace kostní dřeně…..

Delece a Duchennova muskulární dystrofie

• těžká X-recesivní monogenně dědičná choroba

• primární příčina: mutace v dystrofinovém genu (Xp21)

• incidence choroby 1:3500 chlapců

• destrukce svalových vláken (dystrofin - intracelulární protein exprimovaný v hladkých, kosterních a srdečních svalech…)

největší gen (2,5 Mb), vysoká mutační rychlost - 1/3 mutací vznik de novo – 2/3 zděděny - ženy přenašečky X+Xm

Fenotyp člověka s muskulární dystrofií

1) špatné držení těla, potíže při zvedání se ze země (Gowersův manévr)

2) narůstající svalová slabost (3 – 5 let)

3) pseudohypertrofie lýtek

4) lordóza

• většina pacientů má abnormální EKG

• 1/3 vykazuje mírnou mentální retardaci

• pacienti nepřežívají 20. rok života !

Mutace v dystrofinovém genu

Genetický defekt u postižených mužů:

• delece jednoho či více exonu v genu (50-70 %) (cca 200-400 bp)

• bodová mutace nefunkční dystrofin

Mutace v genech BRCA1 a 2

Geny BReast CAncer genes 1 a 2 hrají klíčovou roli při opravě poškozené DNA, což pomáhá udržovat genetickou stabilitu buněk. Mutace mohou způsobit, že gen již nevytváří funkční protein, což znamená, že poškozená DNA není správně opravována. To vede k akumulaci genetických poškození, což zvyšuje pravděpodobnost vzniku rakoviny. • Četnost: 1 : 800

Mutace v genech BRCA1 a BRCA2 mohou vést ke zvýšenému riziku vzniku určitých typů rakoviny, zejména rakoviny prsu a rakoviny vaječníků, ale také rakoviny prostaty, pankreatu nebo melanomu

Rakovina prsu

Ženy s mutacemi v BRCA1 nebo BRCA2 mají až 79,5% - 88 % riziko vzniku rakoviny prsu během svého života (oproti průměrnému riziku kolem 12% u běžné populace).

Rakovina vaječníků

U BRCA1 je riziko kolem 40–50 %, zatímco u BRCA2 se pohybuje mezi 10–20 %. Další druhy rakovin:

Muži s mutacemi v BRCA1 a BRCA2

mají zvýšené riziko rakoviny prostaty. Také existuje zvýšené riziko pankreatické rakoviny a melanom

dědičnost mutací v BRCA1 a 2

– autozomálně dominantní: Mutace v BRCA1 a BRCA2 jsou dědičné a mohou být předány jak od matky, tak od otce. Pokud jeden z rodičů nese mutaci, má jejich dítě 50% šanci, že tuto mutaci zdědí.Testování na mutace v BRCA1 a BRCA2 je doporučeno osobám s rodinnou anamnézou rakoviny prsu nebo vaječníků, aby mohly být přijaty preventivní opatření, jako je častější sledování nebo preventivní operace (např. mastektomie).

Trinukleotidové repetice

- široce rozšířeny v lidském

genomu….např. CAG …mohou zvyšovat počet opakování

* v intronech

* uvnitř čtecích rámců (exonech)

• mutace = expanze úseků DNA, které obsahují opakování tří nukleotidů

(např. CAGCAGCAG….), při přenosu mezi generacemi počet tripletových

opakování stoupá – abnormální genová exprese a funkce…

• vznik – poruchy při replikaci, při přenosu do dalších generací se nemoc

objeví ve stále mladším věku – anticipace !

Normální stav → premutace (hraniční počet TR) → plná mutace

choroby asociovaných s expanzí trinukleotidů

Neuromuskulární a neurodegenerativní choroby, např. kenedyho choroba, myotonická dystrofie, huntingtonova chorea

syndrom fragilního chromozomu X

X-vázaná mentální retardace způsobená mutacemi genu FMR1 na Xq27 ….senilní

demence

• incidence 16-25 /100 000 mužů

• více než 99% FMR1 mutací je způsobeno expanzí trinukleotidů CGGn

(normálně 6–

50, mutace více než 230…) – inhibice genové exprese genu FMR1, inaktivace

promotoru)

• plné mutace vznikají přenosem premutací (55-230 od matky)

• název dle cytogenetického nálezu na X chromozomu

Fenotyp syndromu fragilního chromozomu X

• mentální retardace, opožděný vývoj, hyperaktivita, záchvaty vzteku,

autistické chování

• po pubertě dlouhý obličej s prominující bradou, velké uši

Mutace v místech sestřihu

• mutace v nekódujících sekvencích mohou ovlivňovat sestřih primárního transkriptu - vznik abnormální mRNA !

Četnost mutací (frequency)

v určitém genu je obvykle vyjadřována jako počet nových mutací vzniklých v určitém množství buněk či jedinců v populaci

Rychlost mutací (rate)

udává jak často se mění standardní alela na alelu mutantní za určité časové období (počet mutací na bázi na buněčné dělení, či na genom nebo lokus na generaci či jeden cyklus replikace)

Nejpřímější metodou odhadu četnosti mutací dle fenotypu

je sledování incidence nových sporadických případů autozomově dominantního nebo X-vázaného onemocnění s úplnou penetrancí a jasně rozeznatelným fenotypem

Mutační četnost je dána vztahem

U = n / 2N

Kde n je počet postižených dětí s normálními rodiči a N je celkový počet dětí narozených v dané oblasti v daném časovém intervalu

Vznik mutací

a) Spontánní mutace b) Indukované mutace

Spontánní mutace četnost

Četnost: 10-5 – 10-10

Spontánní mutace příčiny

vnitrobuněčné mechanismy (poruchy replikace, spontánní

chemické změny - tautomerní přesmyky bazí, deaminace,

oxidativní poškození, poruchy při reparaci…

• poruchy při meióze, při mitóze…

• látky či faktory vyvolávající mutace v životním prostředí (mutageny…)

• fyzikální, chemické, biologické

Vložení chybné báze při replikaci a její oprava „proofreading“

: chyba DNA polymerázy

Četnost chybně zařazené báze: 10-5

Ve skutečnosti s opravnými mechanismy: 10-7 až 10-9

Oprava chybně zařazených bazí: „proofreading“ pomocí polymerázy….

• existuje též oprava chybně zařazené báze řízené metylací (mismatch repair..)

Vznik posunových mutací

delece, inzerce

oxidativní poškození DNA - působení volných kyslíkových radikálů

Modifikace DNA (oxidační stres…) Oxidativní poškození – nejvíce .OH radikál – hydroxylový (z H2O2 ), superoxidový .O2 Existuje asi 100 různých reakčních produktů s bázemi v DNA ! Příklad: 8-oxodeoxyguanozin – změna párování bazí – s cytozinem nebo adeninem !

Četnosti poškození DNA v jedné buňce za den

Genom všech organismů je každodenně

poškozován mnoha faktory vnějšího prostředí a

produkty vlastního metabolismu.

Za jeden den vznike v buňce:

• 50 000 jednořetězcových zlomů DNA

• 10 dvouřetězcových zlomů

• 10 000 depurinací

• 600 deaminací

• 2000 oxidační lézí

• 5000 alkylací

Převážná část poškození DNA je opravena !

Mutace vznikají v důsledku změn v DNA, které nejsou opraveny buněčnými

reparačními mechanismy !!!

Faktory ovlivňující vznik spontánních mutací

Přesnost mechanizmů replikace DNA, rekombinace, mitózy a

meiózy

• Míra expozice mutagenním látkám přítomným v životním prostředí

• Účinnost mechanizmů opravujících poškozenou DNA

REPARACE DNA

• Místa poškození v DNA (kódující či nekódující sekvence)

tj. oprava DNA

Mutace vznikají v důsledku změn v DNA, které nejsou

opraveny buněčnými reparačními mechanismy !!!

Indukované mutace

skze mutageny

Mutageny mohou být

• fyzikální • chemické • biologické -

Základní typy poškození DNA vyvolané fyzikálními i chemickými mutageny

a) zlomy v DNA b) ztráta bazí c) modifikace bazí d) křížové vazby

Neionizující záření

reprezentují elektrické a magnetické pole, část elektromagnet. záření včetně viditelného světla, ultrafialového a infračerveného záření a laserového záření. Dále do této skupiny řadíme rádiové záření a mikrovlny

Ionizujícím záření

nazýváme takové záření, jehož kvanta mají natolik vysokou energii, že jsou schopna vyrážet elektrony z atomového obalu a tím látku ionizovat

• excitace

• ionizace

UV záření

Sluneční světlo Infračervené záření = 31,9 % Viditelné světlo = 62,7 % UVA = 5,1 % UVB = 0, 3 %

Průchodnost atmosféry pro různé druhy UV záření

• UV-C složka - je zcela pohlcována atmosférou

• UV-B složka - z 90 % pohlcována ozonem, vodními parami, 02 a CO2

• UV – A složka – dopadá na povrch Země

UV záření dopadající na povrch = UV-A + UV-B

Biologické účinky UV záření na člověka

• příznivé účinky UV záření – tvorba vitamínu D, léčba některých chorob

(lupénka, lupus vulgaris, některé ekzémy…)

• nedostatek vitamínu D + vápníku – křivice (rachitis)

Genetické důsledky UV záření

• UV záření představuje neionizující typ záření !!!

(molekula, která zachytila energii fotonu UV záření se dostává do

excitovaného stavu – reaktivní – chemické změny)

• absorbováno povrchem hmoty – malá pronikavost….

• UV záření indukuje tzv. fotoléze

(přímé účinky na nukleové kyseliny, max. absorbce 254 nm)

• dimery, fotoprodukty, zlomy jedno- i dvouřetězcové, oxidativní poškozeni

DNA

• vysoce škodlivé jsou zejména UV-C a UV-B složky, které poškozují

DNA a proteiny…

Cyklobutanové pyrimidinové diméry CPD

• dimerizace sousedních pyriminů v DNA – cyklobutanový kruh

• CPD vznikají v důsledku absorbce UV DNA záření vazbami mezi 5,6 C

• nejčastěji typu TT, méně TC a CC

• jejich přítomnost porušuje sekundární strukturu DNA a replikaci a transkripci – mohou být letální !!!

Reparace DNA - obecně

Enzymaticky řízené procesy, kterými se poškození a chyby v genomové DNA odhalují, opravují a odstraňují

• Fotoreaktivace

• Excizní reparace

• Postreplikační reparace

Oprava poškození Enzymatická fotoreaktivace

Monoenzymatická reverze pyrimidinových dimérů katalyzovaná enzymem fotolyáza a světelným kvantem (300-600 nm) Baktérie, nižší eukaryota, hmyz, rostliny, u savců chybí !!!

Excizní reparace

oprava ve tmě CPD Vyštěpení dimeru pomocí koordinované činnosti enzymů, existují 2 typy excizní reparace: bázová a nukleotidová

bázová excizní oprava

odstranění poškozené jedné báze

nukleotidová excizní oprava

vyštěpení a oprava většího úseku s poškozenou bází (např. dimer)

Postreplikační reparace po účinku UV záření

rekombinační oprava v G2 fázi !

• přítomnost CPD v DNA – dočasná blokáda

replikace – replikace pokračuje – vznik mezer

v dceřinném retězci…

• CPD není odstraněn– jde o toleranci

poškození v matricovém retězci - opravuje se

důsledek poškození…

• oprava mezer v dceřiném řetězci –

postreplikační reparace (vyžaduje

homologní sesterskou chromatidu)

• následné je CPD opraven excizní reparac

• škodlivé účinky UV záření:

- nádory kůže

- předčasné stárnutí kůže

- poškození očí

- suprese imunitního systému

Nádory indukované UV zářením

Přímé poškození

DNA

a) Tvorba reaktivních

kyslíkových

radikálů

b) Imunosuprese

Maligní melanom do

tloušťky 1 mm je téměř

až 100 % léčitelný !!!

UV-index

je mezinárodně standardizovaná bezrozměrná veličina

charakterizující úroveň erytemového slunečního ultrafialového záření dopadající

na zemský povrch, vyjadřující biologický efekt na lidské zdraví. Používá se k

informovanosti obyvatelstva o možném negativním vlivu UV záření na lidský

organismus. UV-index je definován na horizontální povrch. Obyvatelstvo je

informováno o očekávané maximální hodnotě

• u nás se UV-index pohybuje v rozmezí od 0 - 9, v tropickém pásu může

dosáhnout až 15, nebo 16.

• Všeobecně se dá říci, že čím výše je Slunce nad obzorem (za jasného počasí),

tím větší je UV-index. Čím větší UV-Index tím větší dávka UV záření.

Ionizující záření dva typy

elektromagnetické a korpuskulární

elektromagnetické

(vlnová délka 10-17 až 10-23 nm) vzniká periodickou změnou elektrického a magnetického pole, které má původ v určitém zdroji a šíří se prostorem – hmota ve formě energie – částice foton (paprsky X, g-záření)

korpuskulární

tvoří proud rychle letících elementárních atomových částic, jader atomů, které mohou mít kladný či záporný náboj nebo mohou být neutrální (elektrony, protony, neutrony, a-částice)

Jednotky dávky záření

gray a sievert

gray

Jeden gray odpovídá energii záření jednoho joule absorbované

jedním kilogramem látky.

1 Gy = 1 J/kg = 1 m2·s–2

• Gray je mírou fyzikálních účinků ionizujícího záření, která

nevyjadřuje jeho účinky na živé organismy. Např. ozáření celého

těla člověka dávkou asi 10 až 20 Gy je smrtelné, ačkoliv odpovídá

energii pouze asi 1 kJ, kterou lidský organismus získá asi ze čtvrt

gramu cukru. Naproti tomu sievert je jednotka, která má

zahrnovat biologické účinky záření, v závislosti na druhu záření a

jeho energii.

Sievert

Sievert (Sv) je jednotkou dávkového ekvivalentu ionizujícího záření. Je

pojmenována po Rolfu Sievertovi, průkopníkovi radiační ochrany.

• 1 Sv je taková absorbovaná dávka, která při jakémkoliv typu ionizujícího

záření vyvolá v organické látce stejný biologický účinek. Jednotkou je

J/kg a vypočítá se jako D x Q, kde D je dávka (Gy) a Q je jakostní

faktor, různý pro různé organické látky a jednotlivé druhy

ionizujícího záření. Pro foton je Q=1.

• mSv - milisievert