Biochemia ćwiczenia kwasy nukleinowe

kwasy nukleinowe są

nierozgałęzionymi bipolimerami zbudowanymi z 4 rodzajów monomerów

zasady azotowe

heterocykliczne związki aromatyczne pochodne puryny/pirymidyny. dwupierścieniowe cząstki zbudowane są z sześcioczłonowego pierścienia pirymidynowego i pięcioczłonowego pierścienia imidazolowego (C i N)

zasady purynowe

adenina, guanina

metabolity zasad purynowych

ksantyna i hipoksantyna

zasady pirymidynowe

cytozyna, tymina, uracyl (orotan prekursor uracylu)

zasady purynowe i pirymidynowe wykazuj zdolność do

przekształceń tautomerycznych (odwracalne wewnątrzcząsteczkowe przemieszczanie się atomów wodoru

zasady posiadające grupę aminową mogą występować w formie

aminowej -NH2 lub iminowej =NH

zasady posiadające grupę hydroksylową mogą występować w formie

laktymowej (enolowej -OH) lub laktamowej (ketonowej =O)

adenina może przyjmować formę

aminową lub iminową

guanina i tymina mogą przyjmować formę

enolową lub ketonową

głównymi formami tautomerycznymi guaniny i hipksantyny są

lakamy

dominującą formą adeniny jest forma

aminowa

dominującą postacią tyminy i uracylu jest

laktam

dominującą formą cytozyny jest

laktyn

zasady purynowe i pirymidynowe mogą łączyć się z

cząsteczką 5C monosacharydu, rybozą lub deoksyrybozą tworząc nukleotydy (deoksyrybonukleotydy, rybonukleozydy)

wiązania w nukleozydzie

kowalencyjne wiązanie N-glikozydowe o konfiguracji beta powstaje pomiędzy anomerycznym atomem węgla C1 monosacharydu i N-9 puryny lub N-1 pirymidyny

nukleotydy są

estrami nukleozydów i kw. ortofosforowego (nukleozydofosforanami)

powstawanie nukleotydów

grupa fosforanowa zostaje przyłączona do grupy OH przy C5’ pentozy wiązaniem estrowym = nukleozydowmonofosforany, dwie kolejne reszty fosforanowe zostają przyłączone bogatymi w energię wiązaniami bezwodnikowymi (pirofosforanowymi) (di,tri-fosforany)

obecność reszty fosforanowych w nukleotydach wpływa na

wzrost ich rozpuszczalności w wodzie

nukleozydy i zasady azotowe wykazują

słabą rozpuszczalność w wodize

w komórkach syntetyzowane są tylko

nukleozydo-5’-fosforany

nukelozydo-3;-fosforany powstają

podczas degradacji kwasów nukleinowych

dla nukleotydów typu 3’ należy

podać numer atomu węgla a dla 5’ można go pominąć

nukleotyd tyminowy

dTMP - deoksytymidynomonofosforan w DNA a w tRNA TMP (rybonukleotyd)

nukleotyd uracylowy

występuje w postaci rybonukleotydu a jako prekursor dTMP jest deoksyrybonukleotydem zawierającym deoksyrybozę

nukleotydy adeninowe, guaninowe, cytozynowe mają postać

zarówno deoksyrybonukleotydó jak i rybonukleotydów

nukleotydy adeninowy i guaninowy występować mogą też

w postaci cyklicznej, w której reszta kw. ortofosforowego przyłączona jest równocześnie do C3’ i C5’ rybozy wiązaniem fosfodiestrowym - cAMP, cGMP

cAMP, cGMP

katalizatory: cyklaza adenylanowa, guanylanowa - wtórne przekaźnki informacji w regulacji metabolizmu przy udziale niektórych hormonów

nukleotydy monofosforanowe rola

składniki kwasów nukleinowych, substratami do ich syntezy są nukleotydy trifosforanowe

do syntezy RNA substratami są

ATP, GTP, CTP, UTP

do syntezy DNA wykorzystywane są

dATP, dGTP, dTTp

kwas deoksyrybonukleotydowy

nośnik informacji genetycznej zapisanej w postaci określonej sekwencji nukleotydowej, skład DNA jest charakterystyczny gatunkowo/osobniczo, koduje kolejność nukleotydów we wszystkich cząsteczkach RNA (mRNA, tRNA, rRNA) i kolejność aminokwasów w cząsteczkach białek

DNA posiada strukturę

pierwszo, drugo, trzecio rzędową

struktura pierwszorzędowa określa kolejność

ułożenia nukleotydów w łańcuchu polinukleotydowym

struktura drugorzędowa łańcucha DNA

przedstawia dwie helikalnie zwinięte nici DNA stabilizowane wiązaniami wodorowymi pomiędzy komplementarnymi zasadami azotowymi

struktura trzeciorzędowa DNA

opisuje specyficzne ułożenie cząsteczek DNA w przestrzeni

DNA jest

długołańcuchowym liniowym polimerem złożonym z czterech różnych deoksyrybonukleotydów dAMP, dGMP, dCMP, dTMP które połączone są ze sobą wiązaniami fosfodiestrowymi, reszta fosforanowa połączona wiązaniem estrowym w pozycji C-5’ jednego nukleotydu tworzy drugie wiązanie z grupą hydroksylową C-3’ drugiego nukleotydu

łańcuch DNA jest polarny ponieważ

na jednym jego końcu występuje nukleotyd z wolną grupą hydroksylową przy C-3’ a na drugim nukleotyd zawierający resztę fosforanową związaną z C-5’

cząsteczka DNA składa się

z dwóch przeciwrównolegle ułożonych łańcuchów polinukleotydowych zwiniętych wokół wspólnej osi tworzących podwójną helisę a ich końce 3’ i 5’ znajdują się po przeciwnych stronach, na zewnątrz podwójnej helisy znajdują się reszty deoksyrybozy/fosforanowe (nośniki ładunku ujemnego), hydrofobowe zasady azotowe skierowane do środka

adenina z tyminą wiążą się

dwoma wiązaniami wodorowymi

cytozyna z guaniną wiążą się

trzema wiązaniami wodorowymi

pary zasad AT i GC to pary

zasad komplementarnych

reguła Chargaffa

w dwuniciowych cząsteczkach DNA niezależnie od ich pochodzenia, zawartość tyminy jest równa zawartości adeniny a guaniny cytozyny ( zasada purynowa zawsze wiąże się z pirymidynową)

dwuniciowy DNA istnieje w formach

sześciu, A-E i Z, różniących się właściwościami fizykochemicznymi, kierunkiem skręcenia helisy, długością skrętu, liczbą par zasad na jeden skręt i odchylenia płaszczyzny zasad od osi podwójnej helisy

w warunkach fizjologicznych występuje forma DNA

B - forma symetryczna umożliwiająca replikację, (ale także formy A i Z) 2nm średnicy, prawoskrętna, 10,4 pary zasad na skręt, 2 rowki (mniejszy/większy), kąt odchylenia 1 stopień, uwodnienie 90%

A-DNA

ułatwia powstawanie połączeń DNA-RNA w trakcie syntezy RNA, ma największą średnicę helisy, dwa rowki o identycznych wwymiarach, kąt odychelnia 19 stopni, uwodnienie 75%

Z-DNA pojawia się również w procesie

transkrypcji, jako jedyny z dominujących jest lewoskrętny, ma najwięcej par na skręt helisy, 1 mniejszy rowek, kąt odchylenia 9stopni i 66% uwodnienia

w jądrach komórek eukariotów DNA wiąże się z

białkami o małej masie cząsteczkowej - histonami (kompleks-nukleiono/białkowy)

histony

duża zawartość aminkwasów zasadowych - lizyny i argininy, mają ładunek dodatni, neutralizują wzajemne odpychanie się ujemnie naładowanych szkieletów cukrowo-fosforanowych, umożliwiają ciasne upakowanie DNA w jądrze

w skład kompleksu nukleoprotein wchodzą

DNA, histony, białka niehistonowe, niewiele RNA

podstawową jednostką strukturalną upakowania DNA w jądrze jest

nukleosom - dwuniciowe DNA 150-245 par nukleotydów połączonych z histonami

rdzeń białkowy stanowi

oktamer zawierający po 2 typy histonów H2A, H2B, H3, H4 w postaci lewoskrętnej helisy nawinięty na fragment DNA o długości 165pz

nukleosomy połączone są

fragmentem DNA o długości 40-80 par zasad (łącznikiem) który stabilizowany jest przez histon H1

włókno nukleosomowe

włókno 10nm, 1200 par nukleotydów na 1 skręt

włókno solenoidowe

powstaje przez zwinięcie włókna nukleosomowego, 30nm, następnym stopniem organizacji jest chromatyna interfazowa

chromatyna interfazowa

włókno o grubości 200-300nm, 5×10^4 nukleotydów w pętli

chromosomy

powstają z chromatyny interfazowej, są włóknami o grubości 800nm, 10^8 par nukleotydó

denaturacja (topnienie)

rozerwanie wiązań wodorowych między komplementarnymi zasadami w DNA, co prowadzi do zniszczenia drugo i trzeciorzędowej struktury DNA

temperatura topnienia/meltingu DNA

wartość temperatury, w której 50% cząsteczki DNA ulega denaturacji

renaturacja

powolne oziębienie roztworu DNA powoduje powrót do pierwotnej/natywnej struktury

związki posiadające pierścienie purynowe i pirymidynowe wykazują

silną absorbcję promieniowania ultrafioletowego w zakresie fal o długości 200-300nm (max.260)

właściwości absorbcyjne zasad azotowych wynikają

z obecności w ich pierścieniach sprzężonych wiązań podwójnych oraz heteroatomów, ich widma są podobne ale puryny pochłaniają światło silniej niż pirymidyny

widma zasad azotowych, nukleozydów i nukleotydów

są podobne

EFEKT HIPERCHROMOWY podczas denaturacji DNA następuje

wzrost absorbcji światła o dł. 260nm w porównaniu do cząsteczki natywnej kwasu, bo odsłonięte zasady absorbują silniej światło niż zasady ukryte w helisie

po zakończeniu renaturacji efekt hiperchromowy

ustępuje

cel izolacji DNA

pozyskanie dobrej jakości i czystości wysokocząsteczkowego DNA

kwasy nukleinowe jako polianiony

w komórkach są mocno związane z kationowymi białkami (histonami i innymi) które w izolacji trzeba usunąć

metody ekstrakcji DNA wykorzystują

mieszaniny fenolu i chloroformu do odbiałczania

wysalanie białek komórkowych

zdolność wiązania DNA ze specyficznymi złożami

kluczowe etapy izolacji DNA

przygotowanie materiału

dezintegracja i liza komórek

oddzielenie DNA od wszystkich składników lizatu komórkowego szczególnie od białek i RNA

oczyszczenie i zagęszczenie roztworu DNA

przygotowanie materiału

oczyszczanie, rozdrabnianie, zawieszenie w buforze, usunięcie zanieczyszczeń np. medium hodowlanego, przepłukanie

dezintegracja i liza komórek

do przygotowania lizatów komórkowych -

metody fizyczne (rozcieranie tkanek w ciekłym azocie, wywołanie szoku osmotycznego lub homogenizacja

metody biologiczne - enzymy proteolityczne (proteinaza K, pronaza)

czynniki do dezintegracji błon - detergenty, SDS, sarkozyl, sole chaotropowe chlorowodorek guanidyny, tjocynian guanidyny

SDS oddziela cząsteczki białka od lipidów i je rozładowuje

chleatujące jony metali II wartościowych EDTA

EDTA

Cd2+, Mg2+, Mn2+ które mogą tworzyć sole z grupami fosforanowymi DNA oraz hamuje działanie deoksyrybonukleaz wymagających aktywności Mg2+, Mn2+

oddzielenie DNA od lizatu komórkowego

zastosowanie mieszaniny fenolu i chloroformu, odwodnienie oraz wytrącenie białek (wysolenie) NaCl, wykorzystanie dwóch rozpuszczalników organicznych w metodzie podnosi efektywność, białka oddziela się wirując, powstają trzy warstwy

fenol skutecznie denaturuje białka ale nie hamuje działania

RNaz i jest rozpuszczalnikiem dla zawierających długi fragment poliadenylowy cz. RNA

chloroform w mieszaninie

eliminuje utrudnienia fenolu, związek ten ułatwia rozdzielanie faz wodnej i organicznej

przy ekstrakcji fenolowej pH powinno być

wyższe niż ok.8 ponieważ przy niższym znaczna część DNA pozostaje w fazie organicznej

warstwy w metodzie fenolowo-chloroformowej

górna faza wodna, faza zawierająca kwasy nukleinowe, dolna faza organiczna i wąskie pasmo zdenaturowanego białka na granicy faz (interfaza) - DNA znajduje się w supernatancie, który przenosi się do nowej probówki

oczyszczenie i zagęszczenie roztworu DNA

dodanie alkoholu do fazy wodnej z DNA po ekstrakcji (etanol/izopropanol) zmniejsza polarność środowiska co powoduje odwodnienie kwasu nukleinowego i wytrącenie w postaci nitkowatego osadu (temp 0C lub niższej),

obecność I wartościowych kationów powoduje zwiększenie wydajności - NH4+, Li+, Na+ (2 objętości etanolu i 1 objętość izopropanolu) , osad przemyć 75% etanolem i zostawić do odparowania,

następnie rozpuścić w małej ilości wody dejonizowanej

metody izolacji wykorzystujące adhezyjne właściwości kwasu nukleinowego

zloża krzemionkowe, którymi wypełnia się minikolumny, do przygotowania lizatu bufory lizujące, enzymy proteoliteyczne i sole chaotropowe (tiocyjanian guanidyny), usunięcie warstwy hydratacyjnej DNA umożliwia jego wiązanie do złoża

lizat nanoszony na kolumnę, podczas wirowania DNA zatrzymany na złożu, inne składniki usuwane, DNA wymywany z kolumny na koniec wodą

wybór metody ekstrakcji jest uzależniony od

rodzaju kwasu nukleinowego, który chce się otrzymać (DNA genomowe, mitochondrialne, plazmidowe), jego pochodzenia (zwierzęcy, roślinny, bakteryjny) rodzaju materiału badanego (wycinki tkanek, hodolwe komórkowe) ooraz oczekiwanej jakości jego przeznaczenia (metody biologii molekularnej)