GW BGZ 2022 Taak 8 - Genexpressie en de celcyclus

Wat is het Rb-eiwit en waarom is het belangrijk?

Het Retinoblastoma-eiwit (Rb) is een belangrijke tumorsuppressor die optreedt als een rem op de celcyclus.

• In zijn actieve, niet-gefosforyleerde vorm bindt Rb aan transcriptieregulatoren zoals E2F.

• Hierdoor worden genen die nodig zijn voor de S-fase geblokkeerd.

• De cel blijft daardoor in G1 en gaat niet delen.

Rb voorkomt dus dat cellen zonder toestemming de S-fase ingaan. Dit is essentieel om ongecontroleerde celgroei (kanker) te voorkomen.

Waar bevindt Rb zich en hoe werkt het in rusttoestand?

Rb zit in de kern van vrijwel alle gewervelde cellen.
In de rusttoestand (G0/G1) is Rb actief (niet gefosforyleerd). In deze toestand:

• Bindt Rb aan transcriptieregulatoren zoals E2F.

• Dit verhindert dat E2F de genen activeert die nodig zijn voor DNA-replicatie.

• Gevolg: geen activatie van S-fase-genen, en de cel blijft in G1.

Kortom: Actief Rb = celcyclusblokkade.

Hoe zetten mitogenen de celcyclus in beweging?

Mitogenen zijn extracellulaire groeifactoren die de cel vertellen dat er gedeeld moet worden.
Wanneer een mitogeen bindt aan zijn receptor:

1. Wordt een intracellulaire signaalroute geactiveerd (bijv. Ras/MAPK).

2. Dit leidt tot activatie van transcriptie van cyclines en CDK’s.

3. Hierdoor worden G1- en G1/S-CDK’s geactiveerd (de exacte combinaties hoef je niet te kennen).

Deze CDK’s vormen de “startmotor” die nodig is om Rb te inactiveren.

→ Zonder mitogenen blijft Rb actief en staat de cel stil.

Hoe inactiveren CDK’s het Rb-eiwit?

Zodra mitogenen CDK’s activeren:

• De actieve CDK’s fosforyleren het Rb-eiwit.

• Fosforylatie verandert de conformatie (vorm) van Rb.

• Hierdoor verliest Rb zijn vermogen om transcriptieregulatoren vast te houden.

• Rb laat E2F los.

Gefosforyleerd Rb = inactief, en kan de celcyclus niet langer tegenhouden.

Wat gebeurt er wanneer E2F wordt vrijgelaten?

Zodra E2F vrijkomt van Rb:

• Wordt E2F actief als transcriptiefactor.

• Het activeert de expressie van genen die essentieel zijn voor de S-fase, zoals:

  • DNA-polymerasen

  • Nucleotide-synthese-enzymen

  • S-fase cyclines

  • Componenten van DNA-replicatiecomplexen

Dit leidt tot:

• Start van DNA-replicatie

• Instellingen van S-fase omgeving

• Voorbereiding op celverdubbeling

E2F is dus de directe “schakelaar” die S-fase-genen aanzet.

Hoe zorgt E2F ervoor dat de cel de S-fase ingaat?

E2F activeert een reeks genen die:

• Het DNA-replicatieapparaat opbouwen

• De cyclines en CDK’s produceren die nodig zijn voor de S-fase

• De synthese van nieuwe nucleotiden stimuleren
  Hierdoor wordt de cel biochemisch klaargemaakt om DNA te verdubbelen.
  Zodra deze genen worden afgelezen, schuift de cel van late G1 → S-fase.

Hoe leiden Rb-inactivatie en E2F-activatie tot celproliferatie?

Als Rb eenmaal is gefosforyleerd en E2F actief is, ontstaat een kettingreactie:

1. S-fase-genen worden geactiveerd.

2. DNA-replicatie start.

3. Cel gaat van G1 naar S.

4. Na S-fase volgen G2 en mitose.

5. De cel deelt.

Dus: Rb-inactivatie → E2F-activatie → celcyclus gaat verder → proliferatie.

Waarom verhindert actief Rb dat de cel in de S-fase komt?

Actief Rb sluit E2F als het ware op.
Zonder vrije E2F kan de cel geen enkel S-fase-gen aflezen.
De cel heeft dus niet de bouwstenen en enzymen om DNA te repliceren → geen S-fase, geen deling.

Rb fungeert als een “checkpoint”:

• Zijn default = rem aan

• Alleen bij juiste signalen (mitogenen) gaat de rem tijdelijk los

Wat zou er gebeuren als Rb permanent inactief is (bijv. bij kanker)?

Als Rb niet meer werkt, dan wordt E2F permanent actief, zelfs zonder mitogenen.
Gevolg:

• S-fase-genen staan continu aan

• DNA-replicatie stopt niet

• Cel blijft ongecontroleerd delen

• Hierdoor ontstaan tumoren

Daarom is het Rb-pad een van de meest verstoorde routes in menselijke kanker.

Wat is de G0-fase?

De G0-fase is een rustfase buiten de actieve celcyclus, waarin de cel:

• niet deelt

• geen voorbereiding voor deling treft

• lage CDK-activiteit heeft

• Rb ongefosforyleerd houdt → E2F blijft geblokkeerd → geen S-fase-genen

G0 is een aftakking vanuit G1, niet onderdeel van de cyclische G1–S–G2–M-cyclus.

Waarom gaat een cel G0 in?

• Geen mitogenen (groeisignalen) → CDK’s blijven inactief.

• Weinig nutriënten / stress.

• Differentiatie (neuronen, spiercellen gaan permanent G0 in).

• DNA-schade → cel stopt delen.

Wat zijn de kenmerken van G0-cellen?

• Lage metabole activiteit maar niet “uitgeschakeld”

• Geen DNA-replicatie, geen mitose

• Ze voeren vaak gespecialiseerde functies uit (bv. neuronen: signaalgeleiding)

• Cycline/CDK-activiteit zeer laag

• Rb actief → blokkeert E2F → geen S-fase-transcriptie

Welke twee soorten G0 zijn er?

1. Reversibele G0 (tijdelijk)

• Cellen kunnen terugkeren naar de cyclus.

• Voorbeelden: hepatocyten, T-lymfocyten, fibroblasten.

• Mitogeen → activeert CDK’s → fosforyleert Rb → E2F actief → terug naar G1.

2. Irreversibele G0 (terminal differentiatie)

• Neuronen, cardiomyocyten, skeletspieren.

• Deze cellen delen nooit meer → celcyclusmachinerie grotendeels afgebroken.

Hoe komt een cel weer uit G0?

• Mitogeen bindt receptor.

• Signaalroute activeert G1-CDK’s.

• Rb wordt gefosforyleerd.

• E2F komt vrij → activeert S-fase-genen.

• Cel keert terug naar G1 → S-fase.

Wat gebeurt er in de G1-fase?

De G1-fase is de eerste fase na mitose.
Functies:

• Cel groeit (proteïnen, organellen).

• Controleert omgevingssignalen (voeding, groeifactoren).

• Maakt eiwitten voor S-fase (cyclines, enzymen).

• Grote beslissing: delen → G1 doorgaan → S-fase of stoppen → G0.

Uitkomstopties in G1

• Verder naar S-fase

• Tijdelijke stop (G0)

• Permanente differentiatie (neuronen, spiercellen)

Wat is de rol van mitogenen en de rol van Rb en E2F bij de G1-fase

Regulatie: Mitogenen

Mitogenen activeren:

• Cycline D–Cdk4/6

• Cycline E–Cdk2

Deze fosforyleren Rb.

Rol van Rb en E2F

• Actief Rb + E2F = rem op S-fase-genen

• Gefosforyleerd Rb laat E2F los → E2F activeert genen voor DNA-replicatie → S-fase start

Wat gebeurt er in de S-fase?

De S-fase is de fase van DNA-replicatie:

• Hele genoom wordt exact éénmaal gekopieerd

• Nieuwe histonen gemaakt

• Centrosomen worden gedupliceerd

Onvolledige replicatie activeert:

• DNA-schaderespons → remt Cdc25

• M-Cdk blijft inactief
  → geen mitose tot DNA volledig is

Hoe wordt de cel voorbereid of de S-fase in de G1-fase?

• ORC zit altijd op de replicatieoorsprong

• Cdc6 bindt ORC

• Helicase MCM wordt geladen → pre-RC gemaakt

• Dit complex is geladen maar inactief

Wat gebeurt er in de G2-fase?

De G2-fase volgt op DNA-replicatie.

Functies:

• Cel groeit verder

• Controleert of DNA volledig en correct is gerepliceerd

• Repareert DNA-schade

• Maakt mitose-eiwitten aan (condensines, tubuline, M-cyclines)

Wat gebeurt er in de M-fase en welke eiwitten spelen een rol?

De M-fase bestaat uit:

• Mitose (kerndeling)

• Cytokinese (cytoplasmadeling)

Belangrijkste eiwitten

• M-Cdk = motor van mitose

• Condensines = compact maken van chromatiden

• Cohesines = houden zusterchromatiden bij elkaar

• Kinesines/dyneïnes = beweging chromosomen

• APC/C = degradeert M-cyclines → exit mitose

Welke cyclines en CDKs reguleren de celcyclus?

Fase	Cycline	Cdk	Functie
G1 → S	Cycline D	Cdk4/6	Activeert Rb → E2F komt vrij
G1 → S	Cycline E	Cdk2	Start S-fase
S-fase	Cycline A	Cdk2	Voortzetting replicatie
G2 → M	Cycline B	Cdk1	Start mitose

Wat zijn CKI’s en hoe werken ze?

CKI’s blokkeren CDK’s zodat de celcyclus stopt.

INK4-familie

• p15, p16, p18, p19

• Remmen specifiek Cdk4/6

• → Rb blijft actief → cel blijft in G1/G0

CIP/KIP-familie

• p21, p27, p57

• Remmen breed Cdk2/Cdk1

• → blokkeren G1/S- en S-fase

Wat is p53 en hoe werkt het bij DNA-schade?

p53 = “guardian of the genome”

p53 wordt geactiveerd bij:

• DNA-schade

• oncogene stress

• hypoxie

Functies

• Activeert p21

• Stopcelcyclus (G1/S of G2/M blokkade)

• Stimuleert DNA-herstel

• Bij zware schade → apoptose

Meer dan 50% van kankers heeft een TP53-mutatie.

Wat is p21 en wat doet het?

p21:

• Wordt geactiveerd door p53

• Remt:

  • Cdk2

  • Cdk4/6

• Hierdoor blijft Rb actief

• → E2F blijft geblokkeerd

• → cel gaat NIET de S-fase in

Kort: p53 → p21 → CDK-rem → Rb actief → geen S-fase

Hoe reguleren Rb en E2F de G1/S-overgang?

• In rust is Rb ongefosforyleerd → bindt E2F → remt S-fase-genen

• Mitogeen → Cdk4/6 + Cdk2 fosforyleren Rb

• Rb laat E2F los

• E2F activeert genen voor DNA-replicatie

• S-fase begint

Mutaties in Rb → controleverlies → kanker (retinoblastoom).

Wat zijn cycline-afhankelijke kinasen (CDK’s)? Wat doen ze?

Cycline-afhankelijke kinasen (CDK’s) zijn enzymen die andere eiwitten activeren of inactiveren door fosforylering.
Ze zijn essentieel voor de voortgang van de celcyclus.

Belangrijk:

• CDK’s zijn altijd aanwezig in de cel.

• Maar ze zijn alleen actief wanneer ze binden aan een cycline.

• Elk actief cycline-CDK-complex stuurt een specifieke fase van de celcyclus aan (G1, S, G2, M).

• CDK’s werken als moleculaire schakelaars die abrupt aan/uit gaan via fosforylering of de-fosforylering.

Wat zijn cyclines en waarom fluctueren ze?

Cyclines zijn regulatoreiwitten die CDK’s activeren.
Ze heten cyclines omdat hun concentratie:

• langzaam stijgt door transcriptie

• plotseling daalt door snelle afbraak via het APC/C-complex (ubiquitine → proteasoom)

Rol van cyclines:

• binden aan CDK → activeren CDK

• bepalen welke CDK’s op welk moment actief zijn

• garanderen dat processen in de juiste volgorde plaatsvinden

Hoe worden cyclines gereguleerd?

Cyclines worden gereguleerd door twee complementaire processen:

1. Synthese op het juiste moment (transcriptie):
   Elke cycline wordt pas aangemaakt wanneer de cel die nodig heeft.

   • G1-cyclines in G1

   • S-cyclines in S-fase

   • M-cyclines in G2/M

2. Gerichte afbraak (proteolyse):
   Wanneer een fase is voltooid, worden cyclines snel opgeruimd via ubiquitinatie en afbraak in het proteasoom.
   Dit voorkomt dat een Cdk te lang actief blijft.

De concentratie cycline in een cel is dus altijd een balans tussen synthese en afbraak.

Hoe worden CDK’s zelf aan/uit gezet?

CDK’s worden niet alleen gereguleerd door hoeveelheid cycline, maar ook door remmende en activerende fosfaten:

• CDK’s bevatten remmende fosfaten → CDK blijft uit, ook al is het cycline aanwezig

• Een specifieke fosfatase verwijdert deze remmende fosfaten → plots wordt CDK actief

Dit creëert abrupte, schakelachtige overgangen tussen fasen.

Hoe detecteert de cel DNA-schade?

• Dubbelstrengs breuken (DSB):
  → herkend door MRN-complex → activeert ATM

• Replicatiestress / enkelstrengs DNA:
  → herkend door RPA + ATRIP → activeert ATR

ATM en ATR activeren:

• CHK1

• CHK2

• p53

Deze leiden tot celcyclusstop of apoptose.

Hoe veroorzaakt DNA-schade een celcyclusstop?

Via p53:

1. ATM/ATR fosforyleren p53 → p53 wordt stabiel

2. p53 activeert p21

3. p21 remt G1/S-CDK en S-CDK

4. DNA-replciatie wordt geblokkeerd → celcyclus stopt

In G2:

• ATM/ATR remmen Cdc25 fosfatase → M-CDK blijft inactief → geen mitose

Wat is de invloed van DNA-schade op transcriptie?

Upregulatie van:

• DNA-reparatiegenen (BRCA1/2, RAD51, GADD45)

• CDK-remmers (p21)

• Pro-apoptotische genen (PUMA, NOXA, BAX) bij ernstige schade

Downregulatie van:

• Cyclines (E, A)

• Cdk’s

• E2F-doelgenen

• Proliferatiegenen

Conclusie:
De cel schakelt van een proliferatief programma naar een herstel- of apoptoseprogramma.

Welke factoren zijn schadelijk voor DNA?

Chemisch:

• Alkylating agents

• Polycyclische koolwaterstoffen (PAK’s) uit rook

• Nitrosamines

• Mycotoxines (aflatoxine)

Fysisch:

• UV → thymine-dimeren

• Röntgen/gammastraling → dubbelstrengs breuken

Intern:

• ROS (oxidatieve stress)

• Replicatiefouten

• Endonucleasen

Biologisch:

• HPV, HBV (integratie → mutaties)

Wat is apoptose en waarom is het belangrijk?

Apoptose = geprogrammeerde celdood.

Functies:

• verwijdert beschadigde of gevaarlijke cel

• voorkomt kanker

• vormt weefsels tijdens ontwikkeling

• houdt weefsels in balans (homeostase)

Geen ontsteking, want cel valt netjes uiteen in apoptotic bodies.

Waarom moeten cyclines snel en specifiek afgebroken worden?

Cyclines moeten snel worden afgebroken omdat ze maar korte tijd actief mogen zijn.
Ze sturen de overgang tussen celcyclusfasen, dus als ze te lang blijven functioneren:

• zou een Cdk onterecht actief blijven;

• kan de cel te vroeg of te laat naar een volgende fase gaan;

• kunnen fouten ontstaan zoals herreplicatie van DNA of vroegtijdige mitose;

• verhoogt de kans op DNA-schade en oncogenese.

Cyclines zijn tijdelijke signalen. Zodra een fase voltooid is, moeten ze direct weg, zodat:

• de celcyclus maar in één richting verloopt (onherroepelijke overgang);

• fasen elkaar niet overlappen;

• checkpoints hun signaal kunnen geven.

Daarom zijn cyclines professioneel kortlevende eiwitten: hoge synthese, hoge afbraaksnelheid.

Met welk mechanisme breekt de cel cyclines en andere celcyclus-eiwitten af?

Via het ubiquitine-proteasoom systeem:

1. Ubiquitinering:
   Een doel-eiwit krijgt een keten van ubiquitines opgeplakt door E1-, E2- en vooral E3-ligases.
   Polyubiquitinering = “label voor vernietiging”.

2. Herkenning door het proteasoom:
   Het 26S-proteasoom bindt het gemarkeerde eiwit en trekt het in zijn holte.

3. Afbraak:
   Het eiwit wordt in kleine peptiden geknipt en aminozuren worden gerecycled.

Zo verdwijnen cyclines snel, specifiek en gecontroleerd, wat essentieel is voor correcte fasen-overgangen.

Welke rol speelt APC/C bij de regulatie van cyclines?

APC/C (Anaphase-Promoting Complex) is een E3-ubiquitine-ligase dat:

• Cyclines ubiquitineert, waardoor ze door het proteasoom worden afgebroken.

• Vooral actief is in de overgang van metafase → anafase → G1.

• Onmisbaar is om M-cycline op te ruimen.

Als cyclines niet tijdig worden afgebroken, wordt de celcyclus verstoord:

• Cdk's blijven te lang actief

• Overgangen worden niet afgerond

• De cel kan niet een nieuwe cyclus ingaan

APC/C is dus essentieel voor een correct einde van de mitose.

Waarom is snelle afbraak van veel pas gemaakte eiwitten (zoals cyclines) geen energetische verspilling?

Antwoord:
Omdat:

• de celcyclus extreem strak gereguleerd moet worden;

• een verkeerde timing leidt tot DNA-schade, miscondenserende chromosomen, kanker;

• de aminozuren gerecycled worden voor nieuwe synthese;

• controle over de tijdelijkheid van signalen (zoals CDK-activiteit) belangrijker is dan een beetje energieverbruik.

Het is dus een nuttige investering om fouten te voorkomen.

Wat zijn de drie hoofdcontrolepunten van de celcyclus en wat controleren ze?

1. G1/S-controlepunt

Controleert of:

• de omgeving goed is (groeifactoren, voedingsstoffen);

• het DNA niet beschadigd is.

Bij DNA-schade:
p53 ↑ → p21 ↑ → remt Cdk → cel stopt of gaat naar G0.

2. G2/M-controlepunt

Controleert of:

• al het DNA volledig is gerepliceerd;

• er geen DNA-breuken zijn.

Indien schade:
Chk1/Chk2 remmen o.a. Cdc25, waardoor M-Cdk inactief blijft → cel blijft in G2.

3. Spindle assembly checkpoint (M-controlepunt)

Controleert of:

• alle chromosomen correct aan het spoelfiguur vastzitten via hun kinetochoren.

Indien niet:
→ APC/C blijft inactief
→ geen separase activatie → geen anafase.

Hoe remt de cel de overgang van G1 naar S wanneer DNA beschadigd is?

1. DNA-schade activeert ATM/ATR

2. Deze activeren p53

3. p53 activeert p21 (Cdk-remmer)

4. p21 bindt aan G1/S-Cdk-complexen

5. DNA-replicatie wordt onmogelijk

6. Cel stopt → tijd voor herstel of apoptose

Het G1/S-checkpoint is het belangrijkste anti-kankersysteem van de cel.

Wat is Cdc25 en welke rol speelt het in voortgang van de celcyclus?

Cdc25 is een fosfatase dat remmende fosfaten verwijdert van Cdks.
Hierdoor wordt een Cdk-cyclin-complex volledig actief.

Cdc25 is essentieel voor:

• G2 → M-overgang (M-Cdk activatie)

• Minder uitgesproken: G1 → S

Zonder Cdc25 blijft M-Cdk remmend gefosforyleerd en komt de cel niet in mitose.

Wat zijn de vier grote manieren waarop de cel Cdk-activiteit reguleert?

1. Cycline niveaus

   • synthese (aanmaak)

   • proteolyse (afbraak via APC/C + proteasoom)

2. Fosforylatie

   • Remming: Wee1 voegt remmend fosfaat toe

   • Activatie: Cdc25 verwijdert remmend fosfaat

3. CDK inhibitor eiwitten (CDKI’s)

   • p21, p27 → binden als remhouders, blokkeren de activiteit

4. Externe en interne signalen

   • Extern: groeisignalen bepalen of cel in G1 → S mag

   • Intern: DNA-schade activeert p53 → p21 → CDK stop

Wat is een kinetochore en wat doen ze?

Een kinetochoor is een grote eiwitstructuur die zich op de centromeren van chromosomen vormt en dient als een hechtingspunt voor de mitotische spoelvezels. Deze structuur is essentieel voor het correct splitsen van chromosomen tijdens zowel de mitose als de meiose, waarbij het de verbinding tussen het chromosoom en de spoelvezels regelt om ervoor te zorgen dat elke dochtercel het juiste aantal chromosomen krijgt.

• Locatie: Het kinetochoor assembleert op een gespecialiseerd deel van het chromosoom, het centromeer, dat ook wel de "insnoering" van een chromosoom wordt genoemd.

• Verbinding: Het kinetochoor verbindt de chromosomen met de spoelvezels (microtubuli) van de mitotische spoel.

• Chromosoomsegregatie: Tijdens celdeling (mitose en meiose) hechten de kinetochoren van zusterchromatiden zich aan de spoelvezels die naar de tegenovergestelde polen van de cel wijzen.

• Beweging: Wanneer de zusterchromatiden gescheiden worden, trekken de spoelvezels via de kinetochoren de chromatiden naar hun respectieve polen, wat zorgt voor een nauwkeurige verdeling van het genetisch materiaal over de twee nieuwe dochtercellen.