Biotecnología Médica y Molecular – Resumen de Conceptos Clave

Tarjetas de estudio en formato pregunta-respuesta que abarcan los principales conceptos de diagnóstico molecular, inmunoensayos, proteínas terapéuticas, biotecnología de anticuerpos, vacunas, edición génica, secuenciación de nueva generación y biotecnología animal y celular.

¿Qué cuatro características fundamentales debe reunir un método de diagnóstico molecular?

Alta especificidad, alta sensibilidad, bajo costo y rapidez en la obtención de resultados.

¿Cómo se define un biomarcador de enfermedad?

Molécula presente en tejidos o fluidos de individuos enfermos que muestra diferencias cuantitativas o cualitativas respecto a tejidos normales.

¿Qué ventaja aportan las proteínas glicosiladas como biomarcadores?

Mayor estabilidad y capacidad de interacción específica con receptores celulares.

¿Cuáles son las dos regiones funcionales de un anticuerpo y su función principal?

Región constante (efectora, determina isotipo) y región variable (reconocimiento del antígeno).

¿Qué son los CDR en un anticuerpo?

Loops hipervariables dentro de la región variable que conforman el sitio de unión al epítopo.

¿En qué consiste la producción de anticuerpos policlonales?

Inmunizar un animal, extraer suero tras varias dosis y obtener una mezcla de anticuerpos contra distintos epítopos del antígeno.

¿Para qué se realiza un ELISA de titulaje en antisuero policlonal?

Para determinar la mayor dilución del suero que aún muestra unión antígeno-anticuerpo (título).

¿Cuál es la enzima y el principio de detección más común en ELISA indirecto?

Una enzima unida al anticuerpo secundario que convierte un sustrato incoloro en producto coloreado.

¿Qué innovación introdujo la tecnología de hibridomas de César Milstein?

La obtención de anticuerpos monoclonales de única especificidad y afinidad constante.

Nombre los tres pasos básicos para generar un anticuerpo monoclonal.

1) Inmunización y extracción de bazo, 2) Fusión de linfocitos B con células de mieloma, 3) Selección de clones productores específicos.

¿Cómo funciona un ELISA tipo sándwich?

Un anticuerpo de captura inmovilizado retiene el antígeno; un segundo anticuerpo marcado contra otro epítopo lo detecta generando señal.

En el test de embarazo, ¿qué anticuerpos se encuentran en la zona de captura y en la de control?

Zona de captura: anticuerpos policlonales anti-hCG; zona de control: anticuerpos anti-IgG que reconocen el anticuerpo monoclonal marcado.

¿Qué molécula se detecta para seguimiento de cáncer de ovario y con qué plataforma?

Proteína HE4 mediante ELISA de captura con anticuerpos monoclonales y unión biotina-estreptavidina.

Explique diagnóstico directo vs. indirecto con un ejemplo.

Directo detecta al patógeno (ej. ARN viral); indirecto detecta consecuencias (ej. anticuerpos o hCG en embarazo).

Enumere los cuatro pasos del Western Blot clásico.

1) SDS-PAGE, 2) Transferencia a membrana, 3) Bloqueo e incubación con anticuerpos, 4) Detección enzimática o quimioluminiscente.

¿Por qué suelen usarse anticuerpos policlonales en Western Blot?

Porque la proteína está desnaturalizada y se necesitan anticuerpos que reconozcan múltiples epítopos lineales.

Indique dos ventajas y dos limitaciones del método Western Blot.

Ventajas: alta especificidad y confirmación de tamaño. Limitaciones: necesidad de anticuerpos de calidad y cuantificación relativa.

¿Qué son las LFIA (tiras de flujo lateral) y cuál fue su primera gran aplicación?

Ensayos de inmunocromatografía rápidos; la primera aplicación masiva fue la tira reactiva de embarazo.

Defina proteína terapéutica recombinante.

Proteína producida por ingeniería genética utilizada como fármaco para tratar o prevenir enfermedades.

¿Qué fases clínicas debe superar un medicamento nuevo?

Fase 1 (seguridad), Fase 2 (dosis/eficacia inicial), Fase 3 (eficacia amplia y comparación), antes de la aprobación.

Diferencie anticuerpo quimérico y humanizado.

Quimérico: región variable murina completa + constante humana (~70 % humano). Humanizado: solo CDR murinos injertados en marco humano (>90 % humano).

¿Qué indica el sufijo "-xi" en la nomenclatura de anticuerpos monoclonales?

Que el anticuerpo es quimérico.

¿Qué es un nanobody y mencione una ventaja clave.

Dominio variable de anticuerpo de camélido de cadena pesada; ventaja: tamaño pequeño y alta estabilidad, incluso vía oral.

¿Cómo se prolonga la vida media de proteínas terapéuticas como IFN o hGH?

Pegilación (unión de PEG) o fusión con dominios/albúmina que aumentan tamaño y reducen depuración.

¿Qué enzima recombinante se utiliza en fibrosis quística y qué mutación le mejoró la actividad?

DNAsa I; mutaciones puntuales que reducen afinidad por actina sin afectar la degradación de ADN.

¿Cuál es la ventaja de usar Lactococcus lactis como vector terapéutico?

Es no patógeno, secreta proteínas al lumen intestinal y puede administrar terapias como IL-10 de forma oral.

Explique totipotencia, pluripotencia y multipotencia.

Totipotente forma todo organismo + anexos; pluripotente forma los tres linajes embrionarios; multipotente origina varios tipos relacionados de un tejido.

¿Qué ensayo demuestra la pluripotencia de células madre humanas en ratón?

Formación de teratomas que contienen tejidos derivados de ectodermo, mesodermo y endodermo.

¿Qué factores de Yamanaka reprograman células somáticas a iPS?

Oct4, Sox2, Klf4 y c-Myc.

Mencione una ventaja y una desventaja de las iPS.

Ventaja: autólogas, sin problemas éticos. Desventaja: riesgo de tumorigénesis por c-Myc y mutaciones.

¿Cuál es la diferencia principal entre RNAi y CRISPR-Cas9 respecto a la diana molecular?

RNAi actúa sobre ARN mensajero (knock-down); CRISPR edita ADN directamente (knock-out/knock-in).

¿Qué enzima procesa dsRNA en siRNA durante RNAi?

Dicer.

¿Qué complejo usa el siRNA para degradar el mRNA objetivo?

Complejo RISC (RNA-Induced Silencing Complex).

¿Qué requisito de secuencia necesita Cas9 para cortar ADN?

La presencia adyacente de un motivo PAM (ej. NGG para SpCas9).

Describa brevemente la reparación NHEJ tras un corte de Cas9.

Une los extremos rotos generando inserciones/deleciones que pueden causar pérdida de marco y knockout génico.

¿Qué aplicación permite HDR en edición génica?

Insertar o corregir secuencias específicas usando un templado homólogo diseñado.

¿Cuál es una técnica sencilla para verificar edición CRISPR mediante digestión enzimática?

RFLP: si el sitio de restricción fue mutado por Cas9, la enzima ya no corta el amplicón PCR.

Entre RNAi y CRISPR, ¿cuál suele tener mayor problema de off-target en humanos?

RNAi presenta mayor tasa de off-target por homología parcial con otros mRNAs.

Defina secuenciación de nueva generación (NGS).

Conjunto de métodos de secuenciación masiva en paralelo que generan millones de lecturas a bajo costo y alta velocidad.

¿Qué función cumplen los adaptadores en NGS?

Permiten anclar fragmentos al flowcell, amplificarlos y asignar barcodes para identificar muestras múltiples.

¿Cuál es el principio de la plataforma Illumina?

Secuenciación por síntesis: incorporación secuencial de nucleótidos fluorescentes bloqueados en clusters amplificados sobre un flowcell.

¿Qué ventaja ofrece la lectura paired-end de Illumina?

Secuencia ambos extremos del fragmento, facilitando ensamblaje y detección de inserciones o deleciones.

Nombre una tecnología de tercera generación y su característica clave.

PacBio SMRT: lectura de moléculas individuales con long reads >10 kb en tiempo real.

¿Por qué las lecturas largas son útiles en ensamblado de novo?

Porque atraviesan regiones repetitivas del genoma reduciendo ambigüedades y gaps.

¿Qué es la cobertura (coverage) en secuenciación y por qué importa?

Número medio de veces que se lee cada base; mayor cobertura reduce errores y permite detectar variantes poco frecuentes.

Explique el concepto de RNA-seq.

Secuenciación del transcriptoma para cuantificar niveles de expresión y descubrir isoformas o genes nuevos.

¿Qué representa un heatmap de expresión génica?

Visualización de niveles relativos de transcripción (colores) de múltiples genes entre diferentes muestras o condiciones.

En microarrays, ¿qué significa un fold-change log2 de +2?

Que el gen está expresado cuatro veces más en la muestra experimental respecto al control.

¿Cuál es la ventaja de usar códigos de barras (barcodes) en NGS?

Permiten mezclar múltiples libraries en la misma corrida y luego separar las lecturas por muestra.

¿Para qué sirve la técnica Chip-on-Chip o ChIP-seq?

Identificar regiones de unión de proteínas (p. ej. factores de transcripción) al ADN en el genoma.

Durante la producción de animales transgénicos, ¿qué técnica de 5ª generación introduce genes o los silencia de forma precisa?

CRISPR/Cas, TALENs o Zinc-Finger Nucleases para edición dirigida.

¿Cuál es la utilidad principal de la superovulación en programas de transferencia embrionaria bovina?

Incrementar el número de ovocitos/embriones disponibles por hembra y así aumentar la descendencia de animales superiores.

¿En qué consiste la clonación por transferencia nuclear (SCNT)?

Reemplazar el núcleo de un ovocito enucleado por el núcleo de una célula somática del animal a clonar para generar un embrión genéticamente idéntico.