Bioquimia-genetica I1

Caracteristicas de la vida

alta complejidad, diversidad molecular, misma estructura y logica molecular, alto nivel de organización, sistemas alejados del equilibrio, información hereditaria.

Concepto de autopoiesis

Proceso de producción en el cual cada componente participa en la producción o transformación de los demás componentes, incluyendo la producción de un límite externo que especifica el dominio de la organización autopoiética

Modelo teorico de autopoiesis

Replicasa: Una vesícula contiene una replicasa que se autocopia y sintetiza los lípidos de la membrana, cerrando el circuito autopoiético.

Funciones de las enzimas

Transformaciones dirigidas: Específicas y altamente eficientes. Ejemplo: La glucosa se degrada en CO2 y agua rápidamente gracias a las enzimas.

Transferasas

Transfieren grupos entre moleculas

Hidrolasas

rompen moleculas mediante hidrolisis

oxido-reductasas

reacciones de oxido-reducción

Isomerasas

cambian la orientación de enlaces dobles

Liasas

rompen moleculas

ligasas

participan en reacciones de condensación

Propiedades del agua

Polaridad: Distribución externa de electrones en el oxígeno es casi tetrahédrica.

Tensión superficial alta: Permite el paso del agua a través de capilares.

Calor específico: Cantidad de calor necesaria para elevar la temperatura del agua. Calor de evaporación: Alta constante dieléctrica, buen solvente para moléculas polares

Fuerzas que gobiernan interacciones entre biomoleculas

puentes de hidrogeno, interacciones electrostaticas, van der waals, fuerzas hidrofobicas

funciones de las proteinas

motoras, anticuerpos, transporte, estructurales, almacenamiento, catalisis y receptores

Sopa primordial o prebiotica

termino introducido por el soviético Alexander Oparin y es un experimento de metano, amonia e hidrogeno para hacer amino ácidos (Miller-Urey). Por otro lado también se hizo un experimento de cianuro de amonio, urea en condiciones reducturas para hacer pirimidinas y adenina (Joan Oró)

aminoacidos

tienen un carbono quiral excepto la glicina, y todos son los aminoacidos proteicos son levogiros (L)

Enlace peptidico

Unión covalente entre el grupo carboxilo de un aminoácido y el grupo amino de otro, formando una cadena de proteínas. Tiene caracter de doble enlace limitando la rotacion, mas estable en trans.

componentes estructura secundaria

helice a, hoja B plegada, giros B.

Factores estabilizantes de la estructura terciaria y cuaternaria

Puentes disulfuro, interacciones hidrofobicas, puentes de hidrogeno, interacciones electrostaticas.

Funcion mioblobina

lleva oxigeno a la celula, primera proteina cuya estructura se determinó.

medidas de hidropatia

consolidado de tendencias hidrofobicas e hidrofilicas de un aminoacido.

motivos estructurales

zinc fingers: factores de transcripcion, union a ADN mediante histidina con Zn.

leucine zipper: union de proteinas a ADN

helix-loop-helix: factor de transcripción.

Metodos fisicos para determinar estructura de proteinas

1. Cristalografía de rayos X: Alta resolución, requiere cristales de proteína.

2. Resonancia Magnética Nuclear (RMN): Permite estudiar proteínas en solución.

3. Cryo-EM (Microscopía electrónica criogénica): Método moderno de alta resolución.

proteinas globulares

solubles en soluciones acuosas: enzimas, proteinas motoras o de transporte, inmunoglobulinas.

proteinas fibrosas

insolubles y adaptadas a funciones estructurales: colageno, fibroina, queratina

colageno

esta en el tejido conectivo, es una proteína helicoidal left handed, es un ejemplo para hablar de modificaciones post traduccionales. Mutaciones de un aa del colageno tiene efectos devastadores.

fibroina

proteína que compone la seda y las telas de araña, donde se asocian cadenas betas ricas en gli-ala, la tela de araña es un cumulo de hojas beta plegadas.

Inmunoglobulinas (IgG, IgA, IgM)

• Dependen de puentes disulfuro para mantener su estructura y función.

• Agentes reductores como β-mercaptoetanol y ditiotreitol (DTT) pueden romper estos puentes, afectando su funcionalidad.

tipos de modificaciones post-traduccionales

1. Fosforilación (adición de un grupo fosfato) → Regulación de actividad enzimática.

2. Glicosilación (adición de carbohidratos) → Formación de glicoproteínas como gp120 de VIH.

3. Ubiquitinación → Marcaje para degradación proteica.

4. Metilación, acetilación, sumoilación, neddilación → Regulación de estabilidad y localización.

5. Lipidación → Asociación a membranas celulares.

Diferencias entre cofactor, coenzima y grupo prostético

• Cofactor: Componente no proteico necesario para la actividad enzimática (ejemplo: iones metálicos).

• Coenzima: Molécula orgánica no proteica que participa en la reacción enzimática.

• Grupo prostético: Componente covalentemente unido a la proteína (ejemplo: grupo hemo en la hemoglobina).

Interacciones importantes en el plegamiento de proteinas

puentes de hidrogeno, interacciones hidrofobicas, enlaces disulfuro, fuerzas electrostaticas

Cristalografía de rayos X

• Se requiere cristalización de la proteína. • Resolución de hasta 0.1 Å. • Limitaciones: No todas las proteínas cristalizan bien.

Resonancia Magnética Nuclear (NMR)

• Se usa en proteínas en solución.

• Permite obtener datos estructurales a nivel atómico.

• Limitaciones: Menor resolución que rayos X.

Crio-Microscopía Electrónica (Crio-EM)

• Técnica de última generación con alta resolución.

• No requiere cristalización.

• Permite estudiar complejos grandes (ejemplo: cápsides virales).

Tecnicas de Predicción de Estructura de Proteínas

• AlphaFold (DeepMind): Modelo de IA que predice estructuras con alta precisión.

• CASP (Critical Assessment of Protein Structure Prediction): Competencia que evalúa métodos computacionales.

Para que se purifican las proteinas

1. Caracterización estructural y funcional: o Determinación de estructura por cristalografía de rayos X. o Cinética enzimática, especificidad de sustrato, etc.

2. Usos prácticos en laboratorios e industria: o Enzimas como RNA polimerasa, ligasa, recombinasa. o Producción de anticuerpos, vacunas, rennet (cuajo enzimático), etc.

Metodos de purificacion y analisis de proteinas

• Metodologías preparativas: Permiten obtener grandes cantidades de proteína pura.

• Metodologías analíticas: Se utilizan para caracterizar proteínas y estudiar sus propiedades.

Materia prima para purificación de proteinas

Bacterias recombinantes, celulas de insecto, hibridomas B, leche, rumiante

que es la disrupción celular

Cuando la proteína de interés se encuentra dentro de la célula, es necesario romper la membrana celular para liberarla. Esto se logra por métodos mecánicos o químicos.

Metodos mecanicos para romper la membrana celular

1. Sonicación → Uso de ultrasonido para romper células.

2. Prensa francesa → Aplicación de alta presión para romper células.

3. Homogeneización → Uso de potter, mortero, Dounce, etc.

4. Congelación/descongelación → Forma cristales de hielo que rompen la membrana celular.

Metodos quimicos para romper la membrana celular

1. Detergentes (Triton X-100, Tween) → Rompen membranas lipídicas.

2. Lisozima → Digestion de la pared celular de bacterias.

3. Colagenasa y dispasa → Rompen matriz extracelular en células animales.

Proteínas de membrana requieren detergentes para su solubilización.

Requisitos de cuidado de la muestra

1. Mantener la muestra a 4°C → Minimiza actividad enzimática no deseada.

2. Uso de tampones → Control de pH y fuerza iónica.

3. Inhibidores de proteasas → Evitan degradación proteica.

4. Inhibidores de kinasas y fosfatasas → Previenen modificaciones post-traduccionales indeseadas.

5. Evitar agentes oxidantes → Protege puentes disulfuro.

Propiedades de la purificacion de proteinas

• Precipitación con sales (salting-out): Solubilidad en presencia de sulfato de amonio.

• Cromatografía de exclusión molecular: Peso molecular.

• Cromatografía de intercambio iónico: Carga neta de la proteína.

• Cromatografía de afinidad: Especificidad de unión a ligandos o anticuerpos.

Factores necesarios para la precipitación de proteinas

• Por pH: Se ajusta el pH al punto isoeléctrico (pI) de la proteína, donde su solubilidad es mínima.

• Por temperatura: Algunas proteínas precipitan al calentarlas (Ej: caseína de la leche).

• Por enzimas: Uso de quimosina (rennet) para coagulación de leche.

• Por sales (salting-out): Se usa sulfato de amonio (AmSO₄) para concentrar proteínas.

Cromatografia de intercambio ionico

• Catiónica → La fase sólida es negativa y atrapa proteínas con carga positiva.

• Aniónica → La fase sólida es positiva y atrapa proteínas con carga negativa.

Se eluyen con un gradiente de sal o cambio de pH.

Cromatografía de exclusión molecular

• Separa proteínas según su tamaño.

• Las proteínas grandes eluyen primero, porque no penetran la matriz porosa de la columna.

• Las proteínas pequeñas eluyen después, ya que quedan atrapadas en los poros.

Cromatografía de afinidad

• Separa proteínas según su tamaño.

• Las proteínas grandes eluyen primero, porque no penetran la matriz porosa de la columna.

• Las proteínas pequeñas eluyen después, ya que quedan atrapadas en los poros.

Cromatografia de afinidad

Se basa en la unión específica entre una proteína y un ligando inmovilizado en la fase sólida. Ejemplos:

1. Proteína A/G → Purificación de anticuerpos.

2. Ni-NTA → Purificación de proteínas con etiqueta His-tag (6xHis).

3. Anticuerpos específicos → Purificación de proteínas objetivo.

Técnicas de Cromatografía Avanzadas

FPLC (Fast Protein Liquid Chromatography)

• Similar a HPLC pero a menor presión.

• Se usa para separación rápida de proteínas en solución acuosa.

HPLC (High-Performance Liquid Chromatography)

• Mayor eficiencia y resolución.

• Puede utilizarse para separar proteínas según hidrofobicidad o carga.

Criterios de pureza de proteinas

• Un solo pico de absorción en 280 nm en cromatografía.

• Una sola banda en SDS-PAGE.

• Una sola señal en espectrometría de masas.

Metodos de analisis de pureza

1. Electroforesis en condiciones denaturantes (SDS-PAGE).

2. Isoelectroenfoque (IEF).

3. Electroforesis bidimensional (2D-PAGE).

SDS-PAGE: Separación de proteínas por tamaño molecular

• Se usa SDS (dodecilsulfato de sodio) para desnaturalizar proteínas y darles una carga negativa uniforme.

• Las proteínas migran según su tamaño, con las más pequeñas moviéndose más rápido en el gel.

Preparación de la muestra para SDS-PAGE

1. Adición de SDS (1.4 g SDS/g proteína) para eliminar la carga natural de la proteína.

2. Uso de β-mercaptoetanol → Rompe puentes disulfuro.

3. Calentamiento a 95°C para desnaturalizar completamente.

4. Adición de glicerol para aumentar densidad de la muestra.

Tinción de proteinas en gel

• Azul de Coomassie (método estándar, menos sensible).

• Tinción de plata (10-100 veces más sensible).

Metodos avanzados de analisis de proteinas

Native PAGE, Zimograma, Western blot, electroforesis bidimensional (2D-PAGE), Espectrometría de masas (MALDI-TOF MS)

Metodos para evaluar la calidad de la proteina obtenida

SDS-PAGE, Western Blot y espectrometria de masas

Native PAGE (Electroforesis sin desnaturalización)

Separar proteínas según su carga y forma sin desnaturalizarlas.

• Se usa cuando se quiere estudiar proteínas en su conformación nativa.

• No se usa SDS ni β-mercaptoetanol.

• Útil para analizar complejos proteicos y actividad enzimática.

Zimograma

Detectar actividad enzimática dentro del gel.

• Se realiza en condiciones nativas.

• Se incuba el gel con un sustrato específico.

• Se observa la degradación del sustrato, indicando presencia de la enzima

Western Blot: Detección específica de proteínas

Identificar proteínas específicas usando anticuerpos. Pasos del Western Blot:

1. Transferencia de proteínas desde SDS-PAGE a una membrana (nitrocelulosa o PVDF).

2. Bloqueo de la membrana con leche descremada o caseína.

3. Incubación con anticuerpo primario específico para la proteína de interés.

4. Incubación con anticuerpo secundario unido a una enzima reportera (HRP o fosfatasa alcalina).

5. Revelado mediante quimioluminiscencia (luminol) o cromóforos.

Errores comunes de western blot

• Falta de transferencia → Revisar electrodos.

• Burbujas en el sándwich → Interfiere con el paso de proteínas a la membrana.

• Bandas inespecíficas → Ajustar concentración de anticuerpos y temperatura.

Electroforesis Bidimensional (2D-PAGE)

Separar proteínas por carga y peso molecular simultáneamente. Pasos:

1. Isoelectroenfoque (IEF): Se separan proteínas según su pI en un gradiente de pH.

2. SDS-PAGE: Se separan proteínas según su peso molecular.

Aplicaciones: Comparación de expresión proteica en diferentes condiciones.

• Detección de proteínas mutadas o modificadas post-traduccionalmente.

Espectrometría de masas (MALDI-TOF-MS)

Determinar el peso molecular exacto de una proteína.

1. Se ionizan las proteínas en fase gaseosa.

2. Se aceleran en un campo eléctrico.

3. Se mide su tiempo de vuelo (TOF).

4. Se obtiene la relación masa/carga (m/z).

Tipos de espectrometría de masas

• MALDI-TOF MS → Para análisis de mezclas complejas.

• ESI-MS (Electrospray Ionization) → Para identificar modificaciones post-traduccionales.

Sirve para identificar proteinas nuevas y detectar mutaciones y modificaciones quimicas.

Para comparar la expresión proteica en células cancerosas y células sanas, usaría electroforesis bidimensional (2D-PAGE), seguida de espectrometría de masas (MALDI TOF).

La electroforesis bidimensional separa proteínas según su pI y peso molecular, permitiendo detectar diferencias en la expresión. Luego, MALDI-TOF identifica proteínas diferencialmente expresadas.

Para detectar modificaciones post-traduccionales, utilizaría espectrometría de masas (MALDI-TOF o ESI-MS).

Estas técnicas permiten identificar cambios en la masa molecular de la proteína, lo que puede indicar fosforilación, glicosilación u otras modificaciones.

Para detectar agregados proteicos, usaría Native PAGE o microscopía electrónica.

Native PAGE permite analizar la proteína en su conformación nativa, mientras que la microscopía electrónica puede visualizar directamente los agregados.

Para purificar anticuerpos monoclonales, se usa cromatografía de afinidad con proteína A o G.

Estas proteínas inmovilizadas en la resina se unen específicamente a la región Fc de los anticuerpos, permitiendo su purificación eficiente.

La cromatografía de afinidad con Ni-NTA es la técnica adecuada.

El Ni-NTA (níquel nitrilotriacético) se une específicamente a la etiqueta His-tag, permitiendo la purificación de la proteína recombinante. La elución se realiza con imidazol, que compite por los sitios de unión al níquel.

Para diferenciar proteínas con el mismo peso molecular pero distinta carga, se usa isoelectroenfoque (IEF).

Esta técnica separa proteínas en un gradiente de pH según su punto isoeléctrico (pI).

Para analizar el plegamiento del colágeno, se puede usar electroforesis en condiciones nativas o microscopía electrónica.

También se puede emplear espectroscopía de dicroísmo circular para evaluar su estructura secundaria.