2. Enzymy a jejich role v buňce, katalýza

Co je to enzym?

**Protein, katalyzátor**, **váže** se k jednomu– více ligandům (**substráty**), a přeměňuje je v chemicky modifikované produkty. **Snižují aktivační energie**, vysoce **specifický** a katalyzuje pouze jediný druh reakce. Jejich **katalytická síla** je daná poměrem rychlosti reakce katalyzované enzymem a rychlosti reakce nekatalyzované.

\

Jaká je klasifikace proteinů dle katalyzované reakce?

Jednou z vlastností enzymů je jeho specifita, jaké druhy znáš?

**substrátová specificita** – na úrovni daného substrátu se pak dále rozlišuje ***stereospecificita***

1) schopnost enzymu v racemické směsi __rozpoznat jeden z enantiomerů a pouze ten přeměnit__

2) při syntéze chirální molekuly z achirální (např. při redukci pyruvátu na laktát) __synthetisovat pouze jediný z možných enantiomerů__

Stereospecifita je důsledkem toho, že enzym (a tedy i jeho aktivní centrum) je *vybudován z chirálních monomerních jednotek* (L-aminokyselin), a je proto chirální jako celek.

**katalytická** – katalyzuje specifickou reakci. Dále **kinetickou** specificitu, tedy průběh reakce (rychlost, účinnost, Km).

Specifita zahrnuje, ale také tyto vlastnosti enzymu:

o   __Absolutní specificita__ = reaguje pouze s jediným substrátem

o   __Skupinová specificita__ = reaguje s podobnými molekulami/stejnou funkční skup.

o   „__Linkage specificity__“ = katalyzuje specifickou kombinaci vaze

\
Jak se nazývá bílkovinová a neblíkovinová část proteinu/enzymu?

bílkovina – **apoenzym**; nebílkovina – **kofaktor**

\
Jak se nazývá kofaktor vázaný kovaletně a volně?

kovalentně – **prostetická skupina**; disociovatelný kofaktor – **koenzym**

\
Co je to vazebné místo?

**Aktivní místo**, které připomínají štěrbinu zámku, do něhož může padnout jen konkrétní klíč nebo několik málo klíčů a těmto „klíčům“ se obecně říká **ligandy**. **Vazba** ligandu do vazebného místa je vysoce **specifická** a je zprostředkována **nekovalentními interakcemi (vodíkové můstky, iontové vazby, van der Waalsovy síly, hydrofobní interakce)**. Pevnost vazby ligandu ve vazebném místě určuje – jako u každé chemické reakce – __rovnovážná konstanta__.

Co jsou to ribozymy?

biokatalyzátory tvořené rRNA (ribonukleáza P - štěpí pre-tRNA)

Jak dělíme enzymy dle jejich stavby?

Monomery

* 1 doména váže substrát i kofaktor
* 2 domény, substrát a kofaktor vázané v různých doménách

Oligomery

* Katalytické a regulační podjednotky
* Identické podjednotky

\

• MULTIFUNKČNÍ ENZYMY – více katalytických míst (různé reakce) v jednom polypeptidovém řetězci – *fatty acid synthase*

• MULTIENZYMOVÉ KOMPLEXY – vysoce organizované soustavy několika druhů enzymů – *pyruvate dehydrogenase complex (respiratory chain)*

• ISOENZYMY – katalyzují identické reakce, liší se ve struktuře a vlastnostech – různá afinita k substrátu, různá lokalizace

Jak se biokatalyzátory liší od běžných katalyzátorů?

1) Vyšší reakční rychlostí

2) Mírnějšími podmínkami reakce – T, pH, tlak

3) Vyšší specifitou

4) Schopností regulace

Jaké jsou dvě hypotézy o fungování interakce enzym-substrát?

·       **Hypotéza zámku a klíče** (__Fischerův model__)

\- template hypothesis - *aktivní místo enzymu je komplementární tvaru substrátu* a aktivní místo je rigidní

·       **Teorie indukovaného přizpůsobení** (__Koshlandův model__)

\- dominantní model pro enzymatickou katalýzu

\- *aktivní místo má tvar komplementární substrátu* ***pouze*** *po vazbě substrátu*

\- enzym a/nebo substrát jsou deformovány vazbou E-S, substrát je „__vtlačen__“ do konformace přechodného stavu – je podpořena konverze substrátu na produkt

Čím je charakterizovaná enzymová katalýza?

snížením aktivační energie reakce, zvýšením rychlosti reakce a tím, že se nemění rovnováha (rovnovážná konstanta)

Co vyjadřuje Michaelisova konstanta a jakou má značku?

Když zvyšujeme koncentraci substrátu, nejdříve roste lineárně koncentrace komplexu ES a až nakonec dojdeme do stavu, kdy *všechny molekuly enzymu jsou obsazeny substrátem a rychlost přeměny je maximální (vmax).*

Koncentrace substrátu nutná k tomu, aby enzym pracoval **poloviční rychlostí (vmax/2)** je Michaelisova konstanta (Km).

Michaelisova konstanta (Km) znázorňuje afinitu substrátu k enzymu (= **míra afinity substrátu k enzymu**) u mechanismu fyziologických regulací – např. glykolýza.

***Vlim*** *je ukazatelem aktivity enzymu, maximální rychlost.*

Jak graficky znázorňujeme inhibici enzymové aktivity a jaké druhy známe?

Graficky se lépe určí pomocí tzv. **dvojnásobně reciprokého zobrazení** (Lineweaver -Burk Plot).

Rozlišujeme **reversibilní** (__kompetitivní, nekompetitivní a akompetitivní)__ a **ireversibilní** (vážou se pevně a nevratně kovalentní vazbou).

Jaká je základní charakterizace kompetetivní ihibice?

‐        Inhibitor reaguje s volným enzymem a soutěží se substrátem

‐        Vazné místo v aktivním centru

‐        Může se navázat pouze na volný enzym

‐        V reakční směsi se pak vyskytuje mimo E, S a ES ještě EI (komplex enzym-inhibitor), který se tvoří vratně mezi volným enzymem a inhibitorem

‐        Zvýšení Km

‐        Vlim se nemění

Jaká je základní charakterizace nekompetetivní ihibice?

‐        Inhibitor není podobný substrátu

‐        Váže se jak na volný E tak na komplex ES

‐        Vytváří komplex EI

‐        \[EI\] nezávisí na \[S\], ale pouze \[I\]

‐        Vlim se snižuje

‐        Km se nemění

Jaká je základní charakterizace akompetetivní ihibice?

Inhibitor se váže na komplex ES

Jaké jsou druhy regulace katalytické aktivity enzymů?

\
\- **kladně** (zvyšuje se) nebo **záporně** (snižuje se)

* může být realizována na mnoha úrovních (*genová exprese, kompartmentace souborů enzymů, vazba regulačních molekul na enzym*, *regulace množství vytvořených molekul buňkou, umístěním enzymů do různých oddílů* (víc u membránového systému)

\- příkladem kladné regulace může být situace, ve které produkt enzymatické aktivity, vznikající na jednom místě metabolismu, aktivuje tentýž enzym v jiné metabolické dráze (**hromadění ADP aktivuje enzymy zapojené do oxidace cukrů**)

\- příkladem záporné regulace je tzv. zpětnovazebná inhibice, u které se **produkt reakce katalyzované daným enzymem váže na tento enzym a zpomaluje či zcela zastavuje jeho činnost**

Jak se nezývá schopnost nabývat dvou různých konformací, jak se nazývají enzymy s touto vlastností, které to třeba jsou a co tato schopnost umožňuje?

\- schopnost proteinů **nabývat dvou různých** **konformací**, jejichž aktivita se liší

\- allosterické proteiny – mají více stabilních konformací s různou aktivitou, **přepínáním konformací pak lze regulovat funkci těchto proteinů**

=> ***enzymy, strukturní proteiny, receptory, proteinové motory***

\- předpokladem je, že na povrchu enzymu se musí nacházet **mimo aktivního místa** (do něhož se váže substrát) i jiné **vazebné místo, do něhož se váže regulační molekula**, následkem čeho zpravidla dochází ke konformační změně enzymu

\- typickým příkladem „přepnutí“ mezi konformacemi je **fosforylace** proteinů

Jak difúze ovlivňuje fungování enzymů?

\- koncentrace enzymů a jejich substrátů v buňce nízká, přesto každou sekundu přibližně 1000 reakcí

\- *kinetická teorie hmoty* – hmota se skládá z částic, které se neustále pohybují (tzv. tepelný pohyb) a narážejí do sebe – při vhodné orientaci a síle nárazu může dojít k proměně těchto částic v částice jiné, tedy k chemické reakci

\- enzymy se takto náhodně setkávají se svými substráty a fixují je v aktivním místě v takové orientaci, aby došlo k dané chemické reakci

\- *čím je molekula větší, tím se pohybuje tepelným pohybem pomaleji* – **enzymy proto ve srovnání s malými substráty „stojí“ a frekvence setkání enzymu se substrátem závisí na koncentraci molekul substrátu**

Co to jsou kofaktory enzymů, jaké známe?

\- **malé** **heterocyklické molekuly nebo ionty**

\- jsou to **donory nebo akceptory funkčních skupin, atomů, elektronů**

\- **váží se do aktivního místa** a přenášejí skupiny (atomu) na/z substrátu

VITAMÍNY jsou organické molekuly, __esenciální__ pro biologické procesy vyšších organismů. __Nemohou být syntetizovány lidskými tkáněm__i, mnoho z nich slouží jako __koenzymy__ (vitamín C – kofaktor hydroxylačních reakcí).

Jaké jsou fyzikálně-chemické vlivy na funkci enzymu?

__**Denaturačními vlivy**__ mohou na enzymy působit **těžké kovy, extrémní pH, reaktivní činidla, teplota, UV záření, radiace, oxidace** atd.

Většina enzymů má pH optimum při 7,4, trávící enzymy mají pak optimum v kyselém pH, například alkalická fosfatasa (ALP) pak v alkalickém.

Od určité teploty nastává denaturace enzymu, výjimkou jsou termostabilní enzymy – např. bakteriální polymerasy atd.

Posledním významným vlivem je **složení pufru, jeho iontová síla, přítomnost kofaktorů a iontů**

Kromě změny allosterie, existuje ještě jednou způsob změny funkce enzymu, jaký to je a uveď příklady.

Změna chemického složení enzymu **pevnou kovalentní vazbou,** jedná se o tzv. ***post-translační děj***. *Vnesením/odtržením funkční skupiny se mění konformace proteinu-enzymu a jeho vlastností* – např. katalytická aktivita, stabilita, susceptibilita k degradaci atd.

Příklady modifikací:

**fosforylace** (protein kinasy) vs. **defosforylace** (protein fosfatasy); fosforylace reziduí – Ser, Thr, Tyr

Tím je pak možná regulace esenciálních dějů – buněčný cyklus, diferenciace, metabolismus atd.

Další kovalentní modifikace: **acetylace** (N-terminus; Lys), **ubiquitinace, sumoylace** (Lys), **glykosylace** (N-; O-), **palmitoylace, myristoylace**, …

Jaké jsou fáze proteolytické aktivace?

Rovnováha mezi syntézou a degradací proteinů tzv. **turnover proteinu - dochází ke konstantní degradaci a re-syntéze.**

__Proteinasy (proteasy) a jejich aktivace a inhibice__

1\. __Syntéza__ a sekrece: proenzymy (zymogeny, neaktivní prekurzory)

2\. __Aktivace__: štěpením několika peptidových vazeb a/nebo odstranění krátkého peptidu -> otevření aktivního místa

pepsinogen -> pepsin + 41 AA (vliv HCl)

trypsinogen -> trypsin + 6 AA (enteropeptidáza)

3\. __Inhibice__: proteinové inhibitory (interakcí s proteazou v aktivním místě, a1-anti trypsin – ochrana buněčných stěn)

*Biologický poločas proteinů:*

*<2 h - trávící enzymy, ornithin dekarboxylasa, HMG-CoA-reduktasa*

*<2–200 h většina proteinů*

*>200 h hemoglobin, acetylcholinový receptor*

*Měsíce - kolagen, strukturní proteiny*

Jaké jsou způsoby degradace enzymů?

1\. **Lysozomální proteázy** (*cathepsiny, collagenasa, dipeptidasy*) rozkládají většinu **extracelulárních** proteinů, tzv. „long-lived“ proteins

2\. **Proteasomy** rozkládají abnormální proteiny, „short-lived“ proteins. Při tomto procesu je využita *ubiquitinová kaskáda*.

Jak probíhá ubiquitinace?

__Ubiquitinace, cytosolický protein ubiquitin – kiss of death__

Navázání Ubi na protein jej předurčuje k degradaci v proteasomu, což je oligomer – supramolecularní struktura, která je složena z několika podjednotek (proteinázy).

ubiquitin-COOH + H2N-Lys-protein

 

Degradační signály rozpoznané ubiquitinem:


1. oxidace: Lys, Trp, His, Cys
2. PEST-sequence: Pro, Glu, Ser, Thr
3. NH3-terminus AMK: Arg, Lys, Asp, Phe

Jaké jsou indukce tvorby enzymů?

\
Hlavní úlohu zde hrají **transkripční faktory, cytokiny, receptory** (__jaderné, steroidní, thyroidní, retinoidní__). Syntéza enzymů *de novo* má svůj význam, buňka (organismus) syntetizuje enzym dle svých aktuálních, resp. kvantitativně změněných potřeb. Například energetický metabolismus β- galaktosidázy. *Induktory exprese enzymů jsou často jejich substráty.*

Zmiň dva případy indukce enzymů.

Případ 1:

Jedním případem je indukce enzymu při tzv. drug-drug interactions. To znamená změnu ve farmakokinetice léčiva, což má závažné důsledky ve funkci léčiva a následné nežádoucí účinky.

Pacient po transplantaci ledvin užívá imunosupresivum CYCLOSPORIN a antibiotikum RIFAMPICIN. Cyclosporin je substrátem (je metabolizován) enzymem CYP3A4, rifampicin je silný induktor exprese CYP3A4, pokud se neupraví dávkování cyclosporinu, metabolismus je natolik akcelerovaný, že vymizí terapeutický účinek a pacient umírá na “organ rejection“

Případ 2:

Dalším případem je bioaktivace pro-karcinogenů v ultimátní karcinogeny. Cigaretový kouř, grilované potraviny (steaky, klobásy) a uzeniny obsahují polyaromatické uhlovodíky (PAU) - např. benzo-a-pyren (BaP). BaP sám o sobě není výrazně toxický, BaP je, ale metabolicky přeměňován na velmi reaktivní epoxidy a dioly, které poškozují proteiny a DNA jsou tedy toxické a mutagenní. Hydroxylace BaP je katalyzována enzymy CYP1A1 (všechny orgány včetně plic, střeva, placenty, kůže, játer) a CYP1A2 (hepatospecifický). Indukce CYP1A1 a CYP1A2 působením PAU probíhá přes tzv. aryl uhlovodíkový receptor (AhR). Poznatkem tohoto případu je, že substrát indukuje svůj metabolismus, a zároveň i toxicitu.