Protein Tags

Was sind Protein-Tags? Welche Größen?

An ein Zielprotein angehängte Peptide/Proteindomänen. Einteilung: kurz (6–12 AS), mittel (13–60 AS), lang (>60 AS).

Wofür werden Tags eingesetzt?

Aufreinigung über Affinitätschromatographie, Detektion (enzymatisch, fluoreszent, per Antikörper), Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen und Immunpräzipitation.

Wie fusioniert man ein Protein an einen Tag?

Man kloniert das Gen im richtigen Leseraster in einen Expressionsvektor mit Tag-Sequenz, induzierbarem Promotor und Selektionsmarker. Expression wird induziert (z.B. mit IPTG).

Worauf bei C-terminaler Tag-Klonierung achten?

Das Stop-Codon des Zielgens muss entfernt werden, damit der C-terminale Tag mit abgelesen wird.

Worauf bei N-terminalem Tag / generell achten?

Stop-Codon einbauen, wenn der Tag nicht am C-Terminus sitzt; geeigneten Wirt (T7-Polymerase) verwenden; Leserasterverschiebung unbedingt vermeiden.

Worauf achten bei Proteinen, die ins ER transportiert werden?

Das Signalpeptid wird abgespalten. Den Tag so platzieren, dass er nicht am abzuspaltenden Ende (Signalpeptid) sitzt, sonst geht er verloren.

Aufreinigungsprinzip His-Tag?

6× Histidin bindet über IMAC an immobilisierte zweiwertige Metallionen (Ni²⁺, auch Co²⁺/Cu²⁺/Zn²⁺-NTA-Säule). Elution mit Imidazol (20–250 mM). Nachteil: Imidazol stört NMR/Kristallisation.

Aufreinigungsprinzip Strep-Tag?

Das Strep-Tag (WSHPQFEK) bindet an Strep-Tactin (optimierte Streptavidin-Mutante). Elution mild mit Desthiobiotin. Stört NMR/Kristallisation nicht.

Wofür dienen HA, c-Myc und FLAG?

Es sind Epitop-Tags, vor allem zur Detektion und Immunpräzipitation per spezifischer Antikörper.

Was ist Streptavidin?

Protein aus Streptomyces avidinii, Tetramer aus 4 identischen UE, bindet Biotin extrem stark (eine der stärksten nicht-kovalenten Bindungen). Nicht glykosyliert → weniger unspezifische Bindungen als Avidin.

Vorteil Strep-Tag/Strep-Tactin gegenüber Streptavidin/Biotin?

Die Streptavidin-Biotin-Bindung ist praktisch irreversibel (zu stark) → keine schonende Elution möglich. Strep-Tactin bindet das Strep-Tag reversibel und lässt sich mild mit Desthiobiotin unter nativen Bedingungen eluieren → Protein bleibt aktiv → besser zur Reinigung.

GST-Tag – Matrix, Elution, Vorteil?

Glutathion-S-Transferase (26 kDa) bindet an Glutathion-Matrix, Elution mit Glutathion. Vorteil: erhöht Stabilität und Löslichkeit, gut für Interaktionsstudien (großer Tag).

MBP-Tag – Matrix, Elution, Vorteil/Nachteil?

Maltose-Bindeprotein (~40 kDa) bindet an Amylose-Matrix, Elution mit Maltose. Vorteil: erhöht Löslichkeit (verhindert Inclusion Bodies). Nachteil: kann während der Expression abgespalten werden; Zielprotein fällt danach gern aus.

Warum große Tags, wenn kurze auch reinigen?

Große Tags erhöhen Löslichkeit und Stabilität. Wichtig, weil (v.a. eukaryotische) Proteine in E. coli oft unlöslich als 'inclusion bodies' (denaturiert/inaktiv) anfallen.

Wie entfernt man den Tag nach der Aufreinigung?

Über eingebaute Protease-Erkennungsstellen mit spezifischen Proteasen: z.B. Thrombin, Factor Xa, Enterokinase, TEV, PreScission.

Wie funktioniert die Immunpräzipitation (IP)?

Antikörper-beladene (Magnetic-)Beads binden ein Zielprotein aus dem Lysat und reichern es an (Ungebundenes wird weggewaschen). So lässt sich auch ein gering exprimiertes Protein per WB nachweisen.

Wie unterscheidet sich die Co-IP von der IP?

Die Co-IP fängt zusätzlich die nativ gebundenen Interaktionspartner des Zielproteins mit → dient der Aufklärung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in Signalwegen.

Was ist GFP?

Green Fluorescent Protein aus der Qualle Aequorea victoria (238 AS). Das Fluorophor bildet sich autokatalytisch; nach Anregung mit blauem Licht emittiert es grünes Licht (Nobelpreis 2008).

Wofür wird GFP eingesetzt?

Expressionsstudien (Signalstärke ∝ Expression), Lokalisierung von Proteinen per Fluoreszenzmikroskopie, FRAP. Punktmutations-Derivate mit verschobenen Wellenlängen → Multiplexing.

Wie funktioniert FRAP, was misst man?

Fluorescence Recovery After Photobleaching: Eine ROI wird mit starkem Laserimpuls ausgebleicht, dann am konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop die Rückkehr der Fluoreszenz verfolgt (Nachrücken ungebleichter Moleküle). Voraussetzung: fluoreszenzmarkiertes Protein (z.B. GFP-Fusion). Misst Mobilität/Diffusion und Bindungsverhalten.

Wie funktioniert das Yeast Two-Hybrid-System?

Ein Transkriptionsfaktor wird in DNA-Bindedomäne (an 'bait'/Köder) und Aktivierungsdomäne (an 'prey'/Beute) getrennt. Nur wenn Köder und Beute interagieren, kommen beide Domänen zusammen → ein Reportergen (z.B. lacZ → Blaufärbung mit X-Gal) wird transkribiert.