notatka EM kolos 3 enzymy cz.1

STAŁA MICHAELISA-MENTEN

Miara powinowactwa enzymu do substratu.

stała michaelisa menten określa

ilościowo zależność między szybkością reakcji enzymatycznej (V) a stężeniem substratu [S].

w stałej michaelisa menten KM 

KM = [S] przy V=1/2 Vmax

stała Michaelisa menten to zależność 

odwrotnie proporcjonalna do powinowactwa.

stała Michaelisa menten zależy od

substratu, pH i temperatury.

stałą M-M przedstawia

Krzywa hiperboliczna (M-M) - V= Vmax×[S] / KM+[S]

Wykres Lineweavera-Burkea

- funkcja liniowa,

- równanie podwójnych odwrotności,

- odwrotność szybkości rekacji enzymatycznej w funkcji odwrotności stężenia substratu

- umożliwia wyznaczenie Vmax i KM

modyfikacje nieodwracalne 

• wiązania kowalencyjne

• analogi substratów

• inhibitory samobójcze

wiązania kowalencyjne

Modyfikacja kowalencyjna grup funkcyjnych w centrum aktywnym, trwałe związanie z kofaktorem jak i apoenzymem, reakcja z grupami funkcyjnymi

analogi substratów

Reaktywne analogi substratów – znaczniki powinowactwa

inhibitory samobójcze

Łączą się z grupami funkcyjnymi dążąc do powstania produktu. Produkt wytworzony z nieprawidłowego substratu nie chce opuścić centrum aktywnego i powoduje samobójstwo enzy-mu – NN-dimetyloamina

przykłady nieodwracalnych

• Silne trucizny,

• leki,

• gazy bojowe (połączenia estrowe),

• DIFP, 

• czynniki alkilujące, '

• jony metali ciężkich, '

• azydki,

• cyjanki

• kwas acetylosalicylowy

• betalaktamy

• acyklowir

kwas acetylosalicylowy

kowalencyjne połączenie z sery-ną centrum akt cyklooksygena-zy.

betalaktamy

trwałe połączenie z bakteryjną transpeptydazą (hamowanie proliferacji).

acyklowir

hamowanie wirusowej polimerazy DNA

odwracalne

• kompetycyjne

• niekompetycyjne

• akompetycyjne

• mieszane 

kompetycyjne

WSPÓŁZAWODNICZĄCE)

↑ 𝐾𝑀 − 𝑉𝑚𝑎𝑥

• malonian – deh. burszt.

• etanol dla metanolu/glikolu

kompetycyjne działanie

• Strukturalne podobieństwo do substratu, odwracalne z centrum katalitycznym. '

• Cofnięcie przez zwiększenie st substratu. Zmniejsza powinowactwo enzymu do substratu

niekompetycyjne

(NIEWSPÓŁZAWODNICZĄCE)

− 𝐾𝑀 ↓ 𝑉𝑚𝑎𝑥

niekompetycyjne działanie

• Nie konkurują o miejsce aktywne, strukturalnie niepodobne.

• Łączenie z wolnym enzymem E i kompleksem E-S.

• Inne miejsce niż katalityczne = zmiany konformacji enzymu.

• Zmniejszenie zdolności katalitycznej enzymu.

• Zwiększenie st sub pomaga, ale nie znosi inhibicji

akompetycyjne

↓ 𝐾𝑀 ↓ 𝑉𝑚𝑎𝑥

Stosunek KM do Vmax pozostaje stały

akompetycyjne działanie 

Łączenie inhibitora tylko z E-S i tworzy kompleks E-S-I. Nie wpływa na wiązanie substratu, ale uniemożliwia odłączenie produktu.

mieszane działanie

↑ 𝐾𝑀 ↓ 𝑉𝑚𝑎x

• Mechanizm pośredni, łączący cechy inhibicji kompetycyjnej i niekompetycyjnej

statyny - hipercholesterolemia (KOMP)

reduktaza 3-hydroksy-3metyloglutaryloCoA

kaptopril, enalapril - nadciśnienie (KOMP)

konwertaza angiotensyny

sachinawir, ritonavir - AIDS (KOMP)

proteaza wirusa HIV

acetazolamid, dorzolamid - jaskra (KOMP)

anhydraza węglanowa

sildenafil, vardenafil - zaburzenia potencji, nadciśnienie płucne (KOMP)

fosfodiestrezaza typu V

imatinib - białaczka szpikowa (KOMP)

kinaza tyrozynowa BCR-Abl

metotrexat - terapia przeciwnowotworowa (KOMP)

reduktaza dihydrofolianowa 

neosytgmina, fizostygmina - atonia pooperacyjna jelit, miastemia (KOMP)

acetylocholinoesteraza 

allopurynol - dna moczanowa (KOMP)

oksydaza ksantynowa

Newirapina, efawirenz - AIDS (NIEKOMP)

odwrotna transkryptaza HIV

etopozyd - nowotwory (NIEKOMP)

topoizomeraza II

donepezil - Alzheimer (NIEKOMP)

acetylocholinoesteraza

trazodon - depresja (NIEKOMP)

deamidaza adenozynowa

sole litu - psychoza maniakalno/depresyjna (AKOMP)

monofosfataza inozytolu

mykofenolan mofetil - immunosupresja (AKOMP)

dehydrogenaza inozynomonofosforanowa 

EFEKTORY ALLOSTERYCZNE

• Duże białka o budowie podjednostkowej (oligomeryczne)

• Centra allosteryczne (inne niż katalityczne)

kooperatywność

• zjawisko odzwierciedlone przez sigmoidalny charakter krzywej.

• 1) Na enzymie allosterycznym występuje kilka współdziałających- kooperujących ze sobą miejsc aktywnych substratu.

• 2) Związanie cząsteczki substratu w jednym miejscu aktywnym enzymu lub na jednej podjednostce, indukuje specyficzne zmiany konformacyjne enzymu, a zmiany te przekazywane są do innych miejsc wiążących substrat.

• 3) Przekazane zmiany zwiększają powinowactwo tych pozostałych miejsc do substratu, co ułatwia jego wiązanie do kolejnych podjednostek.

Stała alosteryczna L to

stosunek stężenia enzymu w formie T do fromy R (102-103) -> L=[T]/[R]

LIGANDY – EFEKTORY ALLOSTERYCZNE

wiązanie niekowalencyjne w centrach allosterycznych

AKTYWATORY (często dodatnie sprzężenie zwrotne):

• Stabilizacja formy R

• Otwarcie centrum aktywnego

• Przesunięcie równowagi między formą T a R

• Przesunięcie krzywej sigmoidalnej w lewo.

• Zmniejszenie sigmoidalności

• zanik kooperatywności

• wzrost szybkości reakcji przy niskich stężeniach substratu

forma R 

aktywnej formy konformacyjnej enzymu charakteryzującej się dużym powinowactwem do substratu.

Przesunięcie równowagi między formą T a R

formą T (napiętą i do wyjebania) a R (git w chuj) w kierunku R: T -> R.

Zmniejszenie sigmoidalności

krzywa bardziej hiperboliczna

Działanie aktywatora może prowadzić do

zaniku zjawiska kooperatywności 

Zanik kooperatywności powoduje

wzrost szybkości reakcji przy niskich stężeniach substratu

TYPY AKTYWATORÓW

• EFEKTOR HOMOTROPOWY

• EFEKT HETEROTROPOWY

EFEKTOR HOMOTROPOWY

oprócz funkcji substratu, funkcjonuje jako dodatni efektor przez zwiększenie katalitycznych właściwości innych miejsc wiązania substratu. To zjawisko kooperatywności substratu jest przyczyną sigmoidalnego charakteru krzywej kinetycznej.

efekt homotropowy przesuwa rownowagę 

w kierunku R (powoduje efekt progowy)

EFEKT PROGOWY

poniżej określonego (progowego) stężenia substratu enzym allosteryczny wykazuje małą aktywność, dopiero po przekroczeniu wartośći progowej st substratu aktywność enzymu rośnie bardzo szybko. Jest on bezpośrednią konsekwencją zjawiska kooperatywności, czyli działania substratu jako efektoea homotropowego, oraz dynamicznej równowagi między dwiema formami konformacyjnymi T i R

EFEKT HETEROTROPOWY 

zupełnie inna struktura niż substrat

Rodzaje aktywatorów 

• SYGNALIZATORY NISKIEGO STANU ENERGETYCZNEGO

• INTERMEDIATY SZLAKÓW

• REGULACJA BIOSYNTEZY

SYGNALIZATORY NISKIEGO STANU ENERGETYCZNEGO

• AMP

• ADP

• NAD+

AMP/ADP 

Są dodatnimi regulatorami fosfofruktokinazy 1 oraz deh pirogronianowe

NAD+

Aktywator deh pirogronianowej

INTERMEDIATY SZLAKÓW

• Acetylo-CoA

• Fruktozo-2,6- bisfosforan

• Fruktozo-1,6- bisfosforan

Acetylo-CoA

Aktywator allosteryczny karboksylazy pirogronianowej

Fruktozo-2,6- bisfosforan

Aktywator allosteryczny fosfofruktokinazy 1

Fruktozo-1,6- bisfosforan

Aktywator kinazy pirogronianowe

REGULACJA BIOSYNTEZY

• ATP

• CYTRYNIAN 

ATP

Aktywator allosterycznym karbamoilotransferazy asparaginianowej (enzymu biorącego udział w biosyntezie nukleotydów pirymidynowych)

Cytrynian 

Aktywator allosterycznym karboksylazy acetyloCoA

INHIBITORY

• Stabilizacja formy T

• Przesunięcie równowagi w kierunku T

• zamknięcie centrum katalitycznego

• krzywa sigmoidalna w prawo

• zwiększenie sigmoidalności

• trzeba będzie dodać więcej substratu aby gwałtownie zwiększyć szybkość reakcji katalizowanej przez dany enzym allosteryczny

Przesunięcie równowagi w kierunku T

która ma małe powinowactwo do substratu i małą aktywność katalityczną

zamknięcie centrum katalitycznego

Przyłączenie efektora ujemnego do centrum allosterycznego

karbamoilotransferaza asparaginanowa (inh.all)

CTP

inh. all. w biosyntezie nukleotydów pirymidynowych, uprzywilejowuje formę T

fosfofruktokinaza 1 (inh.all)

ATP, CYTRYNIAN

wysoki stan energetyczny i dostępność substratów cyklu krebsa hamują glikolizę

kinaza pirogronianowa (inh.all)

ATP

ALANINA

wysoki stan energetyczny i nadmiar produktu do glukoneogenezy hamują końcowy etap glikolizy

dehydrogenaza pirogronianowa (inh.all)

ACETYLO-COA

ADP

NADH

wysoki stan i nadmiar produktu hamują przekształcanie pirogronianu w acetylo-CoA

 syntaza cytrynianowa (inh.all)

ATP, CYTRYNIAN

hamowanie cykl. kw. cytrynowego w wysokim stanie energetycznym

karboksylaza acetylo-CoA (inh.all)

MALONYLO-COA

PALMITOILO-COA 

produkty pośrednie syn. kw. tłuszcz. hamują dalszą syntezę

acylotransferaza karnitynowa 1 (inh.all)

MALONYLO-COA

hamuje transprt kw. tłuszcz. do mitoch. zapobiega jednoczesnej syntezie i degradacji 

(reg all) FOSFOFRUKTOKINAZA 1

+ AMP, fruktozo-2,6-bisfosfataza

-ATP, cytrynian

(reg all) KINAZA PIROGRONIANOWA

+ fruktozo-1,6-bisfosfataza

- ATP, alanina

(reg all) KINAZA DEHYDROGENAZY PIROGORNIANOWEJ

+ ADP, CoA, NAD+

- acetylo-CoA. ATP, NADH

(reg all) KARBOKSYLAZA PIROGRONIANOWA

+ acetylo-CoA

(reg all) SYNTAZA CYTRYNIANOWA

- ATP, cytrynian

(reg all) KARBOKSYLAZA ACETYLO-CoA

+ cytrynian

- malonylo-CoA, palmitoilo-CoA

(reg all) ACYLOTRANSFERAZA KARNITYNOWA I

- malonylo-CoA

(reg all) DEHYDROGENAZA IZOCYTRYNIANOWA

+ ADP

- ATP, NADH

(reg all) DEHYDROGENAZA GLUKOZO-6- FOSFORANOWA

- NADPH

MODELE KONFORMACYJNE

opisują w jaki sposób działanie liganda w jednym miejscu wpływa na pozostałe miejsca wiązania na sąsiadujących podjednostkach – jest to znane jako kooperatywność (ale to już powinniśmy umieć)

Model jednoprzejściowy Concerted Model

• Zakłada, że cały enzym jest przekształcony z formy T na R.

• Wszystkie miejsca aktywne podlegają tym samym zmianom jednocześnie.

• Połączenie sub z centrum akt na jednej podjednostce powoduje, że nie tylko ta podjednostka przechodzi w formę R, ale także sąsiadująca

Model sekwencyjny Koshlanda

• Zakłada, że wiązanie liganda przez jedno miejsce kompleksu może wpływać na miejsce sąsiednie bez zmiany wszystkich podjednostek z formy T na R.

• Zmiana na R tylko podjednostki, która wiąże substrat.

RÓWNANIE HILLA

odnosi się bezpośrednio do sigmoidalnej kinetyki nasycenia enzymu allosterycznego i pomaga scharakteryzować zjawisko kooperatywności. Umożliwia oznaczenie stężenia substratu, przy którym szybkość reakcji osiąga połowę szybkości maksymalnej Vmax

Współczynnik Hilla n

parametr empiryczny. Wartość zależy od liczby interakcji między miejscami aktywnymi oraz typu interakcji między miejscami aktywnymi (miejsca allosteryczne i aktywne)

n=1

miejsca aktywne enzymu działają niezależnie od siebie. Kinetyka hiperboliczna, a nie sigmoidalna

n>1

miejsca aktywne są kooperatywne. Wartość n oznacza, że kooperatywność jest silniejsza, a kinetyka nasycenia jest bardziej „sigmoidalna.

n<1

miejsca aktywne wykazują negatywną kooperatywność

interkonwersja

odwracalna modyfikacja kowalencyjna – tworzenie i rozrywanie wiązania kowalencyjnego między E a małą grupą chemiczną. Powoduje zmianę w strukturze III-rz i zmienia jego aktywność katalityczną.

rodzaje interkonwersji 

• Fosforylacja

• Defosforylacja – fosfatazy (EC3)

• ADP-rybozylacja

• Acetylacja

• Adenylacja

• Karboksylacja

• Urydynylacja

Fosforylacja

grupa fosforanowa, kinazy (EC2), dawca to ATP, przyłącza się do OH ser, thr, tyr.

ADP-rybozylacja

• deh glutaminianowa (nieaktywna zmodyfikowana),

• ligaza III,

• terminalna transferaza,

• alfa i beta polimeraza,

• topoizomreazy;

• dawca rybozy to NAD+, ADP-rybozylotransferaza.

Adenylacja

syntaza glutaminowa, przyłączenie AMP z ATP (niezadenylowana aktywna)

REGULACJA HORMONALNA INTERKONWERSJI

Odwracalna modyfikacja kowalencyjna jest stymulowana hormonalnie i stanowi główny mechanizm szybkiego przestawiania całych szlaków metabolicznych (np. glikolizy i glukoneogenezy)

ANTAGONIZM HORMONÓW:

• GLUKAGON I ADRENALINA

• INSULINA

GLUKAGON I ADRENALINA

aktywacja kinazy białkowej A zależnej od cAMP -> fosforylacja (cAMP to aktwyator allosteryczny kinazy białkowej A)

INSULINA

-> aktywacja fosfatazy białkowej -> defosforylacja