PCR

Koji nukleotidi grade DNK, a koji RNK?

DNK: A, G, C, T + dezoksiriboza.

RNK: A, G, C, U + riboza.

Koje su purinske, a koje pirimidinske baze u DNK?

Purinske: Adenin (A), Guanin (G).

Pirimidinske: Citozin (C), Timin (T).

Kako su povezani šećeri u jednom lancu DNK, a kako dva antiparalelna lanca?

Jedan lanac: Fosfodiestarske veze.

Dva lanca: Vodonične veze (A=T sa 2 veze, G≡C sa 3 veze).

Šta definiše 5' i 3' kraj DNK lanca?

5' kraj: Slobodna fosfatna grupa.

3' kraj: Slobodna -\text{OH} grupa.

Koliko nukleotida i gena ima humana ćelija?

Oko 3 × 10^9 nukleotida i oko 30.000 gena.

Ko je i kada otkrio bakteriju Thermus aquaticus i gde?

Thomas Brock, 1966. godine, u termalnim vodama nacionalnog parka Jelouston (SAD).

Ko je postavio koncept PCR-a i koje godine?

Kary Mullis, 1983. godine (Nobelova nagrada 1993.).

Koji reagens/enzim imitira funkciju helikaze u PCR-u?

Nijedan enzim! Visoka temperatura u koraku denaturacije (94{-}96^\circ\text{C}) razdvaja lance i zamenjuje helikazu.

Šta se dešava ako je temperatura denaturacije PRENISKA?

Dolazi do parcijalne denaturacije i brze renaturacije (ponovnog spajanja lanaca), pa prajmeri ne mogu da se vežu \rightarrow mali prinos.

Šta se dešava ako je temperatura denaturacije PREVISOKA ili PREDUGA?

Dolazi do oštećenja DNK, pogrešne ugradnje nukleotida i inaktivacije Taq polimeraze.

Koliko traje i na kojoj T se radi inicijalna denaturacija za sekvence bogate GC parovima?

Traje oko 10 minuta na 95^\circ\text{C} (standardno je 1-3 min) zbog 3 vodonične veze između G i C.

Na kojoj T i koliko traje korak pripajanja (annealing) prajmera?

Na 42°C (najčešće 55 ili 60°C), u trajanju od 30 sekundi do 2 minuta.

U kom pravcu DNK polimeraza sintetiše novi lanac i na kojoj T?

Sintetiše u 5'-3' pravcu, na temperaturi od 72^\circ\text{C}.

Čemu služi završna elongacija i kako se može zaobići?

Služi za kompletiranje parcijalno elongiranih produkata (5-15 min na 72°C). Može se preskočiti ostavljanjem smeše na sobnoj T tokom 30 min.

Koja je formula za izračunavanje broja kopija DNK nakon n ciklusa?

Broj kopija = 2^n (geometrijska progresija).

Zašto je napuštena primena DNK polimeraze iz E. coli?

Zato što nije bila termostabilna – inaktivirala se na T denaturacije, pa se nov enzim morao dodavati ručno nakon svakog ciklusa.

Koji je poluživot (t_{1/2}) Taq polimeraze na

92°C, 95°C, 97°C?

• 92°C 130 min

• 95°C 40 min

• 97°C 5 min

Zašto se PCR Master mix sprema na ledu?

Zato što Taq polimeraza i na sobnoj T (22°C) ugrađuje 25 nukleotida u 100 sekundi, pa bi pravila nespecifične produkte pre početka ciklusa.

Šta su prajmeri i kolika im je standardna dužina i sadržaj G/C?

Kratki jednolančani DNK molekuli dužine 15-40 bp, sa sadržajem G/C od 45-55%.

U kakvom su odnosu Tannealing i T_m (temperatura topljenja) prajmera?

Tannealing treba da bude oko 5°C NIŽA od T_m da bi se povećala verovatnoća vezivanja prajmera za matricu.

Kako višak dNTP-a utiče na PCR reakciju?

Višak dNTP-a vezuje i uklanja slobodne Mg2+ jone, čime se smanjuje aktivnost polimeraze i efikasnost hibridizacije prajmera.

Zašto se MgCl2 čuva na -20°C u malim zapreminama?

Zato što je izrazito higroskopan.

Od kojih soli se sastoji PCR pufer i koji mu je pH?

Sastoji se od Tris-HCl i KCl, a pH iznosi oko 8.

Kolika je preporučena količina DNK uzorka po PCR reakciji?

100–1000 ng po reakciji.

Koliko se DNK dobija iz 1 mL periferne krvi i za koliko PCR-ova je to dovoljno?

Iz 1 mL krvi (4.000 - 11.000 leukocita) dobija se 40 mikrograma DNK, što je dovoljno za 100–400 PCR analiza.

Šta čini TRIzol reagens i koja mu je uloga?

Monofazni rastvor: voda, fenol, gvanidin-izotiocijanat, beta-merkaptoetanol, crvena boja i deterdžent. Služi za lizu ćelija, inaktivaciju nukleaza i očuvanje NK.

Koji su specifični prinosi DNK po uzorcima (bukalni bris, horionske čupice, kosa)?

• Epitel bukalne sluznice: 3mikrog DNK / 1 mg ćelija

• Horionske čupice: 10mikrog DNK / 1 mg tkiva

• Koren kose (folikul): priblizno 300 ng DNK

Zašto je uzimanje horionskih čupica skratilo vreme prenatalnih analiza u odnosu na amniocentezu?

Izoluju se ranije (9–12. nedelja) i nije potrebno prethodno kultivisanje ćelija kao kod amnionske tečnosti.

Na kojoj temperaturi se tkivo inkubira sa proteinazom K?

56°C

Koji se transportni medijum koristi za bris bukalne sluznice, a šta se NE S ME koristiti?

Koristi se transportni medijum ili fiziološki rastvor. NE SME se koristiti etanol (iako ne degradira NK).

Koja je ključna razlika između ekstrakcije na tečnoj i čvrstoj fazi?

• Tečna (fenol-hloroform): razdvajanje na osnovu rastvorljivosti (DNK ide u gornju polarnu vodenu fazu).

• Čvrsta (silika): adsorpcija DNK na silicijum-dioksid (membrana/magnetne čestice) u prisustvu haotropnih soli.

Koji su odnosi alkohola i soli pri precipitaciji DNK?

• Etanol u odnosu 1:2

• Izopropanol u odnosu 1:1

(uz natrijum-citrat, natrijum-acetat ili amonijum-acetat).

Koji su uslovi čuvanja izolovane DNK u vodenom rastvoru (kratkotrajno vs. dugotrajno)?

• 2 - 8 °C: do 72 h (u praksi do 7 dana).

• -20°C: privremeno.

• -80°C ili precipitirana u etanolu na -20°C: dugotrajno čuvanje.

Koji je glavni biološki rizik uzorka i da li je izolovana DNK infektivna?

Svaki biološki uzorak je potencijalno infektivan, dok izolovana DNK u čistom vodenom/etanolnom rastvoru NIJE infektivna.

Na kojoj talasnoj dužini se meri maksimum apsorbancije za nukleinske kiseline?

260nm

Koji su optimalni odnosi apsorbancije (A_{260}/A_{280}, A_{260}/A_{230}, A_{260}/A_{240}) i na šta ukazuje ako su manji?

• A260/A280= 1,7 - 1,9: manji od 1,7 kontaminacija proteinima.

• A260/A230 = 2,0 - 2,4: manji od 2,0 kontaminacija organskim rastvaračima.

• A260/A240= 1,4: manji od 1,4 kontaminacija organskim ili neorganskim solima.

Kako se procenjuje integritet DNK na agaroznom gelu i kako izgleda DNK dobrog kvaliteta?

Procenjuje se elektroforezom na agaroznom gelu. DNK dobrog kvaliteta se sastoji od fragmenata velike molekulske mase sa malom mobilnošću i vidi se kao jasna traka blizu starta (bunarića).

Koje je 5 osnovnih koraka/parametara pri optimizaciji PCR protokola?

1. Količina i kompletna denaturacija DNK uzorka.

2. Koncentracija prajmera i optimalna T_annealing.

3. Optimalna T i vreme elongacije.

4. Broj ciklusa.

5. Optimalna koncentracija \text{Mg}^{2+} jona.

Šta se dešava na niskim, a šta na visokim temperaturama T_annealing pri PCR-u?

• Niske T: nespecifično vezivanje prajmera —> pojava blede trake ili neoočekivanih traka.

• Visoke T: smanjeno vezivanje prajmera za matricu —> pad efikasnosti reakcije.

Kolika je brzina elongacije Taq polimeraze po vremenu?

Standardno vreme elongacije računa se kao 1000 bp / min na 72°C.

Zašto broj ciklusa u PCR-u ne bi trebalo da pređe 45?

Povećanje preko 40-45 ciklusa uglavnom dovodi do stvaranja nespecifičnih produkata, dok količina željenog ciljnog produkta stagnira ili se smanjuje (efekat platoa).

Šta se dešava pri PREVISOKOJ, a šta pri PRENISKOJ koncentraciji Mg2+ jona?

• Visoka Mg2+: pogrešno vezivanje prajmera (\uparrow nespecifičnih produkata) i \downarrow tačnost polimeraze.

• Niska 2+: slaba amplifikacija (mali prinos produkata).