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OSMAC (One Strain Many Compounds)

se ha establecido como una herramienta simple pero poderosa que puede activar muchos clusters de genes biosintéticos silenciosos en microorganismos para producir más productos naturales.

co-cultivo microbiano

simula interacciones ecológicas naturales complejas donde los microbios coexisten en comunidades complejas, activando clusters de genes silenciosos que no se transcriben en ensayos de laboratorio estándar.

Tipos de co-cultivo:

• Hongo-hongo: Interacciones entre diferentes especies fúngicas • Hongo-bacteria: Comunicación cruzada entre dominios • Bacteria-bacteria: Competencia y cooperación bacteriana

Identificación de Microorganismos mediante Pruebas Bioquímicas

• Pruebas de fermentación de carbohidratos

• Actividades enzimáticas específicas

• Perfiles de ácidos grasos

• Características morfológicas y tintoriales

Métodos para la Cuantificación de Metabolitos

• Espectrometría de masas (MS) acoplada a cromatografía líquida (LC-MS) o gaseosa (GC-MS)

• Espectroscopía de resonancia magnética nuclear (NMR) para elucidación estructural

• Espectrometría de masas de alta resolución para identificación de metabolitos desconocidos.

Métodos Comunes Utilizados para el Mejoramiento de Microorganismos para Producir Metabolitos Secundarios a Escala Industria

Tecnología CRISPR-Cas9

Tecnología CRISPR-Cas9

Se ha convertido en la herramienta principal para la ingeniería genómica microbiana, permitiendo modificaciones precisas del genoma bacteriano.

Knockout génico

Eliminación de genes que codifican vías metabólicas no deseadas

Integración dirigida:

Inserción de genes heterólogos para nuevas capacidades biosintéticas

Regulación transcripcional:

Uso de dCas9 para activar o reprimir la expresión génica sin cortes de ADN

Genómica

permite la identificación de variaciones genéticas y mutaciones que afectan la producción de metabolitos.

Aplicaciones de la genomica

Minería genómica

Secuenciación de próxima generación (NGS)

Minería genómica:

Identificación de clusters de genes biosintéticos (BGCs) para metabolitos secundarios mediante análisis comparativo de genomas.

Secuenciación de próxima generación (NGS):

Facilita la caracterización completa de genomas productores y la identificación de nuevas vías biosintéticas.

Transcriptómica

analiza la expresión génica a nivel del transcriptoma, proporcionando información sobre la regulación génica y los efectos de las modificaciones genéticas.

Aplicaciones clave de la transcriptomica

• Análisis de expresión diferencial entre condiciones de cultivo

• Identificación de genes regulatorios clave

• Optimización de condiciones de fermentación basada en perfiles de expresión

Proteómica

estudia la expresión y función de proteínas, proporcionando una comprensión integral del metabolismo microbiano.

Metodologías de la Proteómica

• Electroforesis bidimensional (2-DE) para separación de proteínas • Espectrometría de masas en tándem para identificación y cuantificación

• Análisis de modificaciones post-traduccionales

Arrays de Proteínas (Protein Chip Arrays)

proporcionan una plataforma versátil para la caracterización de cientos de miles de proteínas de manera altamente paralela y de alto rendimiento.

Tipos principales de Arrays de Proteínas

• Arrays analíticos:

• Arrays funcionales:

• Arrays de fase reversa:

• Arrays analíticos:

Utilizan anticuerpos inmovilizados para detección específica

• Arrays funcionales:

Contienen proteínas purificadas para estudios de función

• Arrays de fase reversa:

Utilizan lisados celulares fraccionados

Aplicaciones en microbiología de Arrays de Proteínas

• Identificación de interacciones proteína-proteína

• Análisis de interacciones huésped-microbio

• Perfilado de especificidad de anticuerpos

Epigenómica

estudia modificaciones epigenéticas que regulan la expresión génica sin cambiar la secuencia de ADN.

Modificaciones de histonas:

En hongos filamentosos, las modificaciones de histonas pueden activar clusters de genes biosintéticos silenciosos.

Metilación de ADN:

Aunque menos común en bacterias, puede afectar la expresión de genes biosintéticos.

Lipidómica

se centra en el estudio del lipidoma completo dentro de una célula u organismo.

Optimización de medios:

Análisis del efecto de diferentes fuentes de nitrógeno en el metabolismo lipídico para optimizar la producción.

Ingeniería metabólica

: Modificación de vías lipídicas para producir lípidos específicos o precursores de metabolitos secundarios.

Metabolómica

representa el estudio sistemático de metabolitos presentes en un sistema biológico dado

Ventajas clave de la Metabolómica

• Refleja directamente el fenotipo molecular del sistema

• Proporciona una instantánea de los cambios metabólicos actuales • Permite detección de metabolitos previamente desconocidos

Aplicaciones específicas de la Metabolómica

Optimización de medios de cultivo

Control de procesos

Descubrimiento de biomarcadores

Optimización de medios de cultivo:

Identificación de cuellos de botella en la utilización de fuentes de carbono

• Control de procesos:

Monitoreo en tiempo real de la producción de metabolitos

Descubrimiento de biomarcadores:

Identificación de indicadores de producción óptima

Etiquetado de Sustancias Alimentarias Producidas por GMO

• Cumplimiento con normativas internacionales de seguridad alimentaria

• Documentación completa de modificaciones genéticas

• Evaluación de riesgo ambiental y para la salud humana

Evaluación de Seguridad de GMO y Autorización de Metabolitos Secundarios Producidos por GMO

• La evaluación de seguridad implica análisis exhaustivos de: • Toxicidad:

• Alergenicidad:

• Estabilidad genética

• Toxicidad:

Pruebas in vitro e in vivo para evaluar efectos adversos potenciales.

Alergenicidad:

• Evaluación de potencial alergénico de proteínas nuevas.

• Estabilidad genética:

Confirmación de que las modificaciones permanecen estables durante la producción.

Mejora de los Rendimientos de Productos Utilizando Ciencias Ómicas

Enfoques multi-ómicos:

• Modelado predictivo:

Enfoques multi-ómicos:

La combinación de transcriptómica, proteómica y metabolómica proporciona una visión holística del metabolismo celular.

• Modelado predictivo:

Uso de modelos de escala genómica (GEM) para predecir efectos de modificaciones genéticas.

Antibióticos: Vías Biosintéticas para los Antibióticos y Biosíntesis Modular

La diversidad estructural de los antibióticos deriva de rutas biosintéticas altamente organizadas, que generan compuestos complejos a partir de unidades precursoras simples.

• Vías Biosintéticas para Antibióticos (principales vías biosintéticas responsables de la producción de antibióticos):

1. Vía de los Poliquétidos (PKs, Polyketides)

2. Vía de los Péptidos no Ribosomales (NRPs, Nonribosomal Peptides)

3. Vías Mixtas (Híbridas PKS-NRPS)

4. Vía de los Terpenoides

5. Otros Caminos Secundarios

1. Vía de los Poliquétidos (PKs, Polyketides)

• Utiliza poliquétido sintasas (PKS), enzimas multimodulares. • Se asemeja a la biosíntesis de ácidos grasos, ensamblando unidades de acetato, propionato o malonato. • Ejemplos de antibióticos: • Eritromicina (macrólido, producido por Saccharopolyspora erythraea). • Tetraciclinas. • Rifamicinas.

2. Vía de los Péptidos no Ribosomales (NRPs, Nonribosomal Peptides)

• Catalizada por sintetasas de péptidos no ribosomales (NRPS). • Ensamblan péptidos a partir de aminoácidos, incluso no proteicos (ej. D-aminoácidos, N-metilados). • Ejemplos de antibióticos: • Vancomicina. • Daptomicina. • Bacitracina

3. Vías Mixtas (Híbridas PKS-NRPS)

• Combinan módulos de PKS y NRPS en un mismo complejo biosintético. • Ejemplos: • Epóxomicinas. • Bleomicinas. • Rapamicina (inmunosupresor con actividad antibiótica).

4. Vía de los Terpenoides

• Menos común en antibióticos, pero sí en metabolitos con actividad antimicrobiana. • Ejemplo: Fuscidinas.

5. Otros Caminos Secundarios

• Alcaloides. • Aminoglicósidos (ej. estreptomicina, gentamicina). • β-lactámicos (penicilinas, cefalosporinas), derivados de la condensación de aminoácidos simples.

Vías Biosintéticas para los Antibióticos

Los antibióticos se ensamblan mediante vías biosintéticas modulares que utilizan bloques de construcción similares a los empleados en la síntesis de proteínas, ácidos grasos y polisacáridos

Características fundamentales de las Vías Biosintéticas para los Antibióticos

• Modularidad

• Secuencialidad:

• Flexibilidad evolutiva:

• Modularidad:

Cada módulo es responsable de incorporar una unidad específica del metabolito

• Secuencialidad:

El orden de los módulos determina la secuencia del producto final

• Flexibilidad evolutiva:

Permite diversificación molecular mediante duplicación, deleción o reordenamiento de módulos

• Penicilina:

Derivada de un tripéptido de tres aminoácidos (cisteína, valina y αaminoadipato)

Vancomicina:

Sintetizada por siete módulos que generan un heptapéptido

• Tetraciclina:

Construida a partir de bloques de construcción derivados de acetato

Biosíntesis de penicillina

Tres módulos sintetizan el núcleo tripeptídico, seguido de modificaciones enzimáticas que forman el anillo βlactámico característico

Modulación de penicillina

Las enzimas auxiliares catalizan modificaciones post-sintéticas extensas para generar el producto final bioactivo

Estructura modula de tetraciclina

Cada módulo introduce una unidad de dos carbonos (a veces con cadena lateral de un carbono

Procesamiento de tetraciclina

Los fragmentos de dos carbonos se procesan de diversas maneras para proporcionar características distintivas

Bloques de construcción de de estreptomicina

Utiliza azúcares como unidades básicas

Reacciones de acoplamiento de estreptomicina

Similar a las que ensamblan glucógeno y celulosa

Ventajas evolutivas de las Vías Biosintéticas Modulares

Facilidad de modificación:

Diversidad estructural:

Optimización dirigida:

• Facilidad de modificación

: Los módulos pueden ser insertados, eliminados o reemplazados independientemente

• Diversidad estructural

: Permite generar familias de compuestos relacionados con bioactividades distintas

• Optimización dirigida:

Posibilita la ingeniería racional de nuevas variantes

Ingeniería de vías de las Vías Biosintéticas Modulares

• Intercambio de módulos:

• Híbridos biosintéticos:

• Optimización de expresión:

• Intercambio de módulos:

Reemplazo de módulos específicos para alterar la estructura del producto

• Híbridos biosintéticos:

Combinación de módulos de diferentes vías para crear metabolitos quiméricos

• Optimización de expresión:

Ajuste de niveles de expresión de genes individuales para mejorar rendimientos

Detección de Metabolitos Secundarios con Espectrometría de masas de alta resolución:

LC-MS/MS:

MALDI-TOF

FT-ICR:

• LC-MS/MS:

Separación cromatográfica acoplada a espectrometría de masas en tándem

• MALDI-TOF:

Ionización por desorción láser asistida por matri

• FT-ICR:

Espectrometría de masas de resonancia ciclotrónica de iones para máxima resolución

Detección de Metabolitos Secundarios con Técnicas complementarias

• Resonancia magnética nuclear (NMR):

• Espectrometría de masas de imágenes (IMS):

• Redes moleculares:

• Resonancia magnética nuclear (NMR):

Elucidación estructural detallada

• Espectrometría de masas de imágenes (IMS):

Localización espacial de metabolitos en cultivos

• Redes moleculares: A

grupación de metabolitos relacionados estructuralmente

Plataformas integradas

• Metabolómica dirigida:

• Metabolómica no dirigida:

• Flujo metabólico:

• Metabolómica dirigida:

Cuantificación de metabolitos específicos conocidos

• Metabolómica no dirigida:

Descubrimiento de metabolitos desconocidos

• Flujo metabólico:

Seguimiento de la incorporación de precursores marcados isotópicamente