Chapitre 8 : Molecular regulation of the cell cycle II

1. Analyse des paramètres du cycle cellulaire

A. Analyse in vitro du cycle cellulaire au laboratoire

Pourquoi dit-on que les cellules en culture sont asynchrones, et quelle en est la conséquence pour l’étude du cycle cellulaire ?

Parce que chaque cellule se trouve dans une phase différente du cycle, ce qui permet d’observer toutes les phases simultanément.

Quelle relation existe entre le temps de doublement d’une population cellulaire et la durée du cycle cellulaire ?

Le temps de doublement correspond à la durée totale du cycle cellulaire (Tc).

Comment peut-on déterminer expérimentalement la durée du cycle cellulaire (Tc) en culture ?

Si le nombre de cellules double après un temps donné, ce temps correspond à Tc.

Quel principe est utilisé pour marquer spécifiquement les cellules en phase S ?

L’incorporation d’analogues de la thymidine lors de la réplication de l’ADN.

Quel analogue de la thymidine est le plus couramment utilisé pour marquer la phase S ?

La BrdU (Bromodeoxyuridine).

Quelle est la durée approximative de la phase S indiquée dans ton texte ?

Environ 1 à 2 heures.

Pourquoi le marquage BrdU in vitro ne correspond-il pas uniquement aux cellules en phase S au moment de l’ajout ?

Parce que la BrdU est ajoutée en excès et laissée longtemps, marquant toutes les cellules qui entrent en phase S durant cette période.

Quels éléments sont nécessaires pour détecter la BrdU par immunofluorescence ?

• Anticorps primaire anti-BrdU
• Anticorps secondaire couplé à un fluorochrome pour amplifier le signal

Quel type de microscope est utilisé pour visualiser le marquage BrdU ?

Un microscope confocal.

Quelle protéine est utilisée comme marqueur spécifique de la mitose ?

L’histone H3 phosphorylée (pH3).

→ marqueur spécifique de la condensation de la chromatine.

Pourquoi le marquage par pH3 est-il considéré comme avantageux ?

Parce qu’il est spécifique de la mitose.

Comment peut-on détecter simultanément les phases S et M ?

En combinant BrdU et pH3 avec des fluorochromes différents.

Quelle est la particularité du marqueur Ki67 concernant les phases du cycle ?

Il est exprimé en G1, S, G2 et M, mais absent en G0.

Quelle est la masse moléculaire et la localisation cellulaire de Ki67 ?

Une protéine nucléaire de 360 kDa.

Quelle est la fonction de PCNA dans la cellule ?

C’est un facteur de processivité de l’ADN polymérase δ.

→ Protéine qui augmente la capacité d’une enzyme à être liée à son substrat

Dans quelles phases du cycle PCNA est-il détectable ?

Très présent en phase S, mais aussi détectable en G1 et G2.

Que permettent d’estimer les marqueurs Ki67 et PCNA ?

La fraction de cellules en prolifération.

Quelle technique est utilisée pour les cellules en suspension ?

FACS (cytométrie en flux)

Quel est le principe général de l’analyse du cycle cellulaire par FACS ?

Le marquage de l’ADN par des colorants intercalants, sans remplacement de base.

Quels colorants intercalants sont utilisés pour marquer l’ADN en cytométrie en flux ?

Hoechst 33342 ou iodure de propidium (PI).

Quelle relation existe entre la fluorescence mesurée et la quantité d’ADN ?

La fluorescence est proportionnelle à la quantité d’ADN.

Quelle quantité d’ADN correspond à chaque phase du cycle en FACS ?

• G1 : 2N (46 molécules d’ADN)
• S : entre 2N et 4N
• G2/M : 4N (92 molécules d’ADN)

Pourquoi observe-t-on un faible pourcentage de cellules en phase S en FACS ?

Parce que la phase S est très courte.

Comment se présente la lecture des résultats en cytométrie en flux ?

On trace un histogramme :

• Axe X : intensité fluorescente (=ADN).

• Axe Y : nombres de cellules.

B. Analyse in vivo du cycle cellulaire

Pourquoi l’embryon de souris au jour E12 est-il utilisé pour analyser le cycle cellulaire in vivo ?

Parce qu’E12 correspond à une phase intense de construction du cortex cérébral.

Quelle région embryonnaire est étudiée et quel tissu donnera-t-elle ultérieurement ?

La région dorsale du tube neural va donner le future cortex cérébral.

Quelle est la méthode expérimentale utilisée pour marquer les cellules en phase S chez l’embryon E12 ?

Injection intrapéritonéale de BrdU chez la mère enceinte.

Pourquoi le BrdU injecté à la mère permet-il de marquer les cellules de l’embryon ?

Parce que le BrdU traverse la barrière placentaire.

Quel est le délai entre l’injection de BrdU et l’observation des embryons ?

Les embryons sont sacrifiés 1 heure après l’injection.

Où sont localisées les cellules en phase S dans le cortex embryonnaire E12 ?

Dans la région subventriculaire / intermédiaire.

Que reflète la localisation des cellules en phase S dans le cortex embryonnaire ?

Les mouvements nucléaires appelés “interkinetic nuclear migration'“

Où sont positionnées les cellules en phase M dans le cortex embryonnaire ?

Proche du ventricule

Quel mouvement nucléaire précède la mitose des progéniteurs corticaux ?

Le noyau descend vers la surface ventriculaire pour entrer en mitose.

Quel type de cellules les progéniteurs corticaux produisent-ils majoritairement à ce stade embryonnaire ?

Principalement des neurones.

Quel lien existe entre la position du noyau et le cycle cellulaire des progéniteurs corticaux ?

La position du noyau dépend de la phase du cycle cellulaire et de l’état de la cellule.

Combien de niches neurogéniques actives persistent dans le cerveau adulte et comment s’appellent-elles ?

Deux niches : SGZ et SVZ.

Où est localisée la SGZ dans le cerveau adulte ?

Dans le gyrus dentelé de l’hippocampe.

Quel type de neurones est produit par les progéniteurs de la SGZ ?

Des neurones excitateurs glutamatergiques.

Dans quelles fonctions cérébrales la SGZ est-elle impliquée ?

La mémoire spatiale et la plasticité synaptique.

Que deviennent les nouvelles cellules produites dans la SGZ ?

Elles sont intégrées dans les circuits hippocampiques.

Quels marqueurs sont utilisés pour étudier la neurogenèse dans la SGZ ?

• NeuN : neurones matures
• BrdU : cellules en prolifération

Quel type de neurones est produit dans la SVZ ?

Des neurones inhibiteurs GABAergiques.

Par quelle structure migrent les neuroblastes issus de la SVZ ?

Le Rostral Migratory Stream (RMS), par migration en chaîne.

Quelle est la destination finale des neuroblastes issus de la SVZ ?

Le buble olfactif

Quel est le rôle fonctionnel de cette neurogenèse SVZ–RMS–bulbe olfactif ?

La formation continue d’interneurones olfactifs

Comment se compare l’activité de cette neurogenèse entre rongeurs et humains ?

• Très active chez les rongeurs
• Fortement diminuée chez l’humain après ~6 ans

Quel est l’objectif principal de l’analyse cumulative au BrdU ?

Marquer toutes les cohortes de cellules entrant en phase S.

Quel est le principe expérimental de cette méthode cumulative ?

Administrer un nombre croissant d’injections de BrdU à différents animaux, suivies d’un sacrifice.

Que représente la population analysée dans cette méthode ?

Une moyenne de populations cyclantes

Comment évolue le nombre de cellules BrdU+ au cours du temps ?

Il augmente progressivement, formant une courbe cumulative.

Que signifie l’atteinte d’un plateau de marquage BrdU vers ~18 heures ?

Il correspond à l’ensemble des cellules cyclantes.

Pourquoi le plateau de marquage n’atteint-il pas 100 % ?

Parce que certaines cellules sont quiescentes/latentes (G0) mais sont comptées dans les cellules cyclantes au sens large.

Quelles informations cette méthode permet-elle de déterminer ?

• La fraction de cellules cyclantes
• La durée relative des phases du cycle (avec méthodes complémentaires)

Pourquoi la phase G1 est-elle considérée comme une phase critique dans la régulation du cycle cellulaire neuronal ?

Parce que c’est durant G1 que la cellule décide entre poursuite de la prolifération ou différenciation neuronale.

Quels sont les principaux régulateurs moléculaires contrôlant la progression en phase G1 ?

Les CDK4/CDK6 et les cyclines D (D1, D2, D3).

Quel est le rôle spécifique de CDK6 dans le cycle cellulaire selon ton texte ?

CDK6 est un régulateur positif du passage G1 → S.

Quelle approche expérimentale est utilisée pour étudier le rôle de CDK6 ?

La perturbation ou perte de CDK6 suivie de l’analyse des temps des phases du cycle.

Quel est l’effet principal de la perte de CDK6 sur la dynamique du cycle cellulaire ?

Un allongement marqué de la phase G1.

Comment la durée de la phase G1 influence-t-elle la neurogenèse ?

La longueur de G1 détermine la capacité à produire des neurones.

Quels sont les effets d’un G1 allongé sur le destin cellulaire ?

Il favorise la différenciation neuronale et réduit la prolifération.

Quels sont les effets d’un G1 plus court sur les progéniteurs neuronaux ?

Il favorise l’auto-renouvellement des progéniteurs.

2. Le cycle cellulaire du cortex cérébral en développement

A. Anatomie et organisation du cortex en développement

Quelle contribution majeure de Cajal est mentionnée concernant l’étude du cortex cérébral ?

L’utilisation de la méthode d’imprégnation Golgi

Que permet la méthode de Golgi dans l’étude du cortex cérébral ?

Une visualisation détaillée de l’architecture neuronale, des neurones individuels et de leurs arborisations.

Comment est organisée anatomiquement une coupe coronale du cortex cérébral ?

Le cortex est la partie périphérique externe, organisée en couches neuronales avec un réseau glial.

Quelle particularité morphologique du cortex est observée chez les primates ?

Un cortex très replié (gyrifié), augmentant la densité neuronale par surface.

Que permettent ces replis corticaux supplémentaires chez les primates ?

Des caractéristiques supplémentaires de connectivité.

B. Origines des cellules corticales : types de progéniteurs

Quel événement marque le début du développement cortical selon ton texte ?

Expension massive des cellules neuroépithéliales

Quel est le rôle des cellules neuroépithéliales au début du développement ?

Établir la forme initiale du cortex.

Où sont localisées les cellules neuroépithéliales et quel rôle supplémentaire remplissent-elles ?

Elles sont attachées à la surface ventriculaire et piale et servent de progéniteurs et de guides de migration neuronale.

En quoi se transforment progressivement les cellules neuroépithéliales ?

En cellules de la glie radiaire.

Quel est l’effet des divisions symétriques des progéniteurs corticaux ?

L’amplification du pool de progéniteurs et l’expansion tissulaire.

Quelle est la conséquence de la première phase de divisions asymétriques ?

La production directe de neurones.

Que produisent les divisions asymétriques de la deuxième phase ?

Des progéniteurs intermédiaires (IPC).

Où se situent les progéniteurs intermédiaires et quel est leur rôle ?

Ils siègent entre deux couches et génèrent des neurones supplémentaires.

Que signifie l’organisation corticale « inside-out » ?

Les neurones les plus jeunes migrent au-dessus des plus anciens.

Comment évolue le destin des progéniteurs corticaux au cours du développement ?

Ils produisent successivement :
glie → astrocytes → oligodendrocytes.

C. Migration neuronale et construction des couches corticales

Quel type de support cellulaire est utilisé par les neurones lors de la migration radiaire ?

La glie radiaire, utilisée comme échafaudage pour migrer vers leur couche finale.

Quels types de neurones utilisent principalement la migration radiaire et d’où proviennent-ils ?

Les neurones excitateurs, produits dans le cortex (VZ/SVZ).

Quels neurones utilisent la migration tangentielle et quelle est leur origine ?

Les interneurones inhibiteurs (GABA) issus des ganglionic eminences (MGE et CGE).

En quoi la migration tangentielle diffère-t-elle de la migration radiaire ?

Elle suit des itinéraires indépendants de la glie radiaire.

Quels événements fonctionnels débutent pendant la migration neuronale ?

Émission d’axones, formation de dendrites et établissement de synapses.

Quelles sont les projections axonales des neurones des couches corticales supérieures ?

Vers le cortex opposé, via le corps calleux.

Vers quelles structures projettent les neurones des couches corticales profondes ?

Vers la moelle épinière, via des voies descendantes.

Qu’est-ce que le pruning synaptique et quand intervient-il ?

Une sélection synaptique tardive, dépendante de l’expérience, éliminant les synapses inutiles pour optimiser le réseau.

D. Coordination du cycle cellulaire et la position du stroma des progéniteurs corticaux.

Quel type de mouvement nucléaire est observé chez les progéniteurs corticaux ?

Un mouvement oscillant du noyau.

Où se situe le noyau des progéniteurs corticaux durant la phase S ?

Éloigné de la surface ventriculaire.

Que se passe-t-il avec le noyau en phase G2/M ?

Il redescent vers la ventricule, où a lieu la mitose apicale.

Quel est le comportement des neurones une fois produits concernant le cycle et la mobilité nucléaire ?

Ils entrent en G0 et ne bougent plus.

Comment s’appelle ce phénomène de mouvement nucléaire coordonné au cycle cellulaire ?

Interkinetic Nuclear Movement (IKNM).

Pourquoi ce mouvement nucléaire est-il biologiquement utile ?

Il évite l’encombrement ventriculaire et optimise la production neuronale dans un espace restreint.

Quelle technique permet de suivre le mouvement nucléaire en temps réel ?

La microscopie confocale en time-lapse (image toutes les 30 minutes)

Comment le BrdU est-il utilisé in vivo pour étudier le cycle cellulaire ?

Par injection suivie d’un sacrifice, pour identifier les cellules en phase S.