mikroskopi+lovverk

Forskjell mellom tradisjonelt og veletablert plantebasert LM?

Tradisjonell: Sikker dokumentasjon i minst 30 år (15 år i EØS). Godkjennes etter forenklet dokumentasjon av effekt, og sikkerherten vises i henhold til EMA monografier. Dokumentasjonen baseres på erfaringsbruk og ikke nødvendigvis kliniske effekter

Sannsynlig effekt, men ikke fullstendig bevist

Eks: Bronwel

Veletablert: Er brukt medisinsk i 10 år i EU. Må dokumenteres med kliniske studier og har god vitenskapelig dokumentasjon på effekt. Dokumentasjonen bygger på publiserte studier i litteraturen

A: viser celleveggen i epidermis med spalteåpninger

B: Øvre epidermis→ store bølgete celler

C: Viser Druser som er mange runde stjerneformede strukutrer inneenfor celler. Kalles også kalsiumoksalatkrystaller. Ledningsvev

D viser kjertelhår

E viser dekkhår

b)

Disse er karakteristiske egenskaper ved blader og dermed viser bilde et blad

A: Du ser tydelig øvre epidermis og mesofyllet med palisadevev og svampvev. Palisadeceller står tett og loddrett, mens svampvevet har mange luftrom.

B: Ledningsvev

C: viser epidermis med spalteåpninger

D:Druse

E: viser øvre epidermis uten splateåpninger

F: Kjertelhår

G: E harde, tykke celler fra frøskallet (sclereider) som ser gulbrune og bølgete ut. Litt kalsiumoksalatkrystaller (små steinlignende strukturer)

H: Kjertelhår

B) Tilhører blad

Hva er kostilskudd?

Næringsmidler som reguleres av mattilsynet. Disse har ingen godkjenningsordning og dermed er det forbudt å bruke medisinske påstander her. Disse kan heller ikke reklameres for til bruk av medisinske tilstander

Ulike trinn i kvalitetskontroll

1. valg av biomasse

2. utrekkning gjennom ekstraksjon

3. Analyse av innholdstoffer via teknikker

4. Testing av ekstrakt i bioassays

5. prøveopparbeidelse og fraksjonering ved kromatografi

Hva er plantebaserte legemidler?

Et eller flere virkestoff som er sammensatt av plantematriale. Kan være tabletter eller kapsler som inneholder ekstrakt, te, eteriske oljer eller ulike former for miksturer

Hvilke type ekstrakter har vi?

Flytende ekstrakt: inneholder alt løsemiddel, flytende form og har 1:1 forhold med droge

Tinktur: Mer fortynnet flytende ekstrakt, har 1:5 eller 1:10 forhold med droge

Halvfast ekstrakt: Myk konsistens og deler av løsemiddelet er fjernet

Tørreekstrakt: Fast form, alt løsemiddel er fjernet

Hva er ekstrakter?

Produkt som dannes ved ekstraksjon av en droge som har både aktive og inaktive forbindelser. Løsemiddelet baseres på polariteten til drogen hvor lipofile løsemidler henter ut fettløselige komponenter og visa versa. Etter ekstraksjonen fjernes løsemiddelet enten fullstendig (tørre ekstrakter) eller delvis (halvfaste ekstrakter)

Hva er DER?

Droge-ekstrakt-forhold

Forholdet mellom mengden droge brukt og mengden ferdig ekstrakt

DER= mengde droge brukt/mengde ekstrakt oppnådd

Eks: 4:1 betyr at 4 g droge er brukt for å lage 1 g ekstrakt

Brukes ofte til tørre produkter

Regn ut DER

200mg tørket ekstrakt- 0,2g

1,05-1,5 g tørt produkt

→ 1,05/0,2g= 5,25

Hva er standardisert ekstrakt?

Justert ekstrakt til å inneholde en nøyaktig mengde av en eller flere aktive substanser med kjent terapeutisk effekt

Hva er kvantifisert ekstrakt?

Planteekstrakt der mengden av ett eller flere bestemte innholdsstoffer er målt, men uten at innholdet nødvendigvis er justert til en fast verdi

Bidrar til den samlede terapeutiske virkningen

Hvordan kvantifiseres eteriske oljer?

Vanndampdestilasjon fremstilles det

GC brukes til å analysere og bestemme innholdet i oljene

Hva betyr ekstraksjon, perkolering, droge, DSR, tinktur og renset ekstrakt?

Ekstraksjon: Uttak eller trekking ut av stoffer fra et matriale (eks plante eller sopp eller bakterie). Man bruker et løsemiddel for å trekke ut de kjemiske forbindelsene man ønsker fra biomassen. Prinsippp: Likt løser lik, hvor polare stoffer løses best i polare løsemidler og upolare stoffer i upolare løsemidler

Perkolering: Ekstraksjonsmetode der løsemiddelet renner kontinuerlig gjennom plantematrialet som ligger i en sylinder (perkolator)

Løsemiddelet helles på toppen og trekker gradvis gjennom matrialet

Den ferdige væsken som samles nederst, inneholder de oppløste stoffene→ Brukes ofte for å lage tinkurer eller flytende ekstrakter

Droge: Et plante eller dyrematriale som brukes til medisinsk formål. Kan være hele planten eller deler som rot, blad, bark eller blomst. Droger brukes som råmatriale i ekstraksjon for å fremstille legemidler som te eller eteriske oljer

DSR: Droge til løsemiddelforhold. Brukes for flytende ekstrakter og beskriver hvor mye droge som brukes i forhold til mengden løsemiddel

Eks: 1:10 betyr 1g tørket plante + 10g løsemiddel

Tinktur: Flytende planteekstrakt laget ved å trekke plantematrialet i etanol eller etanol/vann. Inneholder både virkestoffer og løsemiddel. Mer fortynnet enn flytende ekstrakt og DSR forhold er 1:5 eller 1:10

Brukes tradisjonelt som medisinske dråper eller til videre proesessering

Renset ekstrakt: Planteekstrakt der uønskede stoffer er fjernet og de aktive forbindelsene er konsentrert. Kan også være standardisert til en bestemt mengde av et virkestoff

Mer konsistent og effektivt produkt med kjent innhold

Paralell 1: Absorbans 515nm =0,341

Mengde innveid droge: 152 mg som tilsvarer 0,152 g

Paralell 2: absorbans 515nm= 0,388

Masse innveid droge: 155 mg som tilsvarer 0,155 g

Regn ut totalmengde hydroksyantracenglykosider i drogen

Kan den godkjennes?

Formel: (A*1,25 )/ m

0,341× 1,25 / 0,152 = 2,80%

0,388 × 1,25 / 0,155 = 3,15%

2,80%+3,15% / 2 = 3%

Kravet ligger på over 2,5 %, det betyr at drogen er godkjent

Tørrekstrakt: Fast preparat som lages ved  at alt ekstraksjonsmiddelet fjernes etter ekstraksjonen av drogen via en tørkeprosess. Det som står igjen er et konsentrert pulver som inneholder de aktive og inaktive innholdstoffene fra planten

→ Brukes ofte i kapsler og tabletter

→ inneholder ingen rester av løsemiddel

Standarisert ekstrakt: Planteekstrakt som er justert til å inneholde en bestemt mengde av en eller flere kjente aktive substanser. Det er de aktive substansene! Det gjøres for å sikre konsistens i styrke og kvalitet fra batch til batch og for å sikre den terapeutiske effekten er forutsigbart. Standariseringen kan feks være basert på en spesifikk mengde aktive stoffer som sensoider i tilfelle av sennablader 

Standandarisering gir: 

• Reproduserbarhet

• Bedrer sikkerheten

DER: Mengde droge/ mengde ekstrakt

→ 7000g/1400g = 5

DER er 5:1 som betyr at 5 kg tørkende sennablader trangs for å produsere 1 kg tørrekstrakt

Ekstraksjonsmiddel:

For denne kan man bruke etanol og blanding av etanol og vann. De er effektive fordi de ekstraherer både polare og litt mindre polare stoffer som sennosider

Eks på ordinære LM (ikke plantebaserte LM) som inneholder et standarisert ekstrakt. For hvert preparat angi hvilken type naturstoff det er standardisert med hensyn p

Ginkgo biloba preparater:

eks: tebonin, gincosan

Ekstrakt brukt: Ginkgo biloba bladeekstrakt 

Standardisert på flavonglykosider og terpenlaktoner

Naturstoff: Flavonoider og terpener

→ forbedrer blodgjennomstrømning i hjernen mot lette plager

Rød solhatt:

Eks: Echinaforce

Standardisert ekstrakt: Echinacea purpurea urt/rot

Standardisert på kaffeinsyrederivater

→ mot forskjølelse

Vi har en ekstrakt med heksan og en med metanol

Heksan: Mer upolar enn metanol så de upolare stoffene vil lande her hvis vi baserer oss på “likt løser likt”

Kromatografi og silika + stasjonær fase

→ silika plate er mer polar og de mer upoalre stoffene vil komme ut først

1. Triaglyserid 

2. Sitosterol er mer polar enn triaglyserid

Metanol: mer polart og dermed vil de mer polare stoffene gå hit

Kromatografi, C18 og stasjonær fase

C18 er mer upolar og dermed vil holde igjen de mer upolare stoffene. Polar kommer ut først

Siden barbaloin er ganske polar som jeg mener kommer som fraksjon D

Videre mener jeg at rutin kommer da det er et større molekyl og mest polart som fraksjon C

Til slutt kommer emodin som den som er mest upolar som fraksjon E

Bioassay guided fraksjonering:

Betyr at man bruker biologiske tester (Bioassays) til å styre rensingen og isoleringen av aktive forbindelser fra en kompleks blanding. Det virker ved at man tester hver fraksjon for biologisk aktivitet. Fraksjonene som viser aktivitet, fraksjoneres videre. Prosessen gjentas til den aktive forbindelsen isoleres

Metoden brukes ofte i naturstoffkjemi for å finne hvilke molekyler som gir en ønsket biologisk effekt.

Hva vil du bruke av kokende vann, CO2, 10% metanol og 80%etanol til de ulike?

B er veldig polart og dermed vil man bruke kokende vann her for å lage bindinger med stoffet

A er også noe polar og dermed burde man bruke 10% metanol for å lage gode bindinger

C er moderat polar og dårlig vannløslig og dermed krever det en sterkere alkohol

D er upolart og dermed brukes CO2 for mer selektivitet til hydrofobe forbindelser

HPTLC brukes til å kontrollere kvaliteten av urteprodukter ved å sammenligne det kjemiske fingeravtrykket i prøven med en kjent referanse. Ekstrakter av produktene og referansen påføres på en TLC-plate og utvikles i et passende løsemiddel. De ulike forbindelsene danner bånd med bestemte Rf-verdier og farger. Et ekte og korrekt produkt skal gi et båndmønster som samsvarer med referansen. Manglende eller avvikende bånd tyder på feil planteart eller dårlig kvalitet.

Markørsubstanser er kjente, karakteristiske forbindelser som brukes for å bekrefte identitet og kvalitet. De kan være bioaktive stoffer eller typiske signaturstoffer for planten. I eksemplet brukes rosavin og salidrosid som markører for å verifisere at prøvene faktisk inneholder Rhodiola rosea.

i monografien står det at 1,0mL av 0,1 M HCL tilsvarer 24,03 mg total alkaloider

I assay tilsettes 15 mL 0,1M HCL og overskuddet titreres med 0,1M NaOH

HCL brukt: 15-1= 14 mL

14mL *24,03 mg= 336,42 mg

Selve prøven var på 7,47 g

% total alkaloider: 0,33642 g/7,47 g *100% = 4,50%

Kravet er på minst 2% og denne drogen inneholder mer som betyr at den kan godkjennes

Fordeler med en DAD detektor framfor en ordinær UV detektor i HPLC analyse av planteekstrakter?

DAD registrerer hele UV vis spekteret for hver topp, mens vanlig UV detektor måler kun en valgt bølgelengde→ Gir mer informasjon om hver forbindelse

DAD kan sammenligne UV spektre for hver topp med referansestoffer→ Øker sikkerheten i identifikasjonen av komponenter i komplekse planteekstrakter

DAD kan skille forbindelser ved at de har ulike absorpsjonsspektra, selv om de kommer ut samtidig i kromatogrammet

DAD kan velge optimal deteksjonsbølgelengde i ettertid uten å måtte kjøre prøven på nytt

Hvilke tilnærminger har vi?

Etnofarmakologisk- Droger som brukes og hvordan denne kan forklare moderne farmakologisk virkning

Eks: morfin

Kjemotaksonomisk- Utvalg av arter som tidligere er kjent for å produsere spesifike stofftyper som tropanalkaloider

Tilfeldig- baseres på tilfeldigheter uten forkunnskap

Informasjonsdrevet- Kombinasjon av metoder sammen med litteratur

Fordeler og ulemper på tradisjonelle og moderne ekstraksjonsmetoder

Hvilke analysemetoder har vi?

GC

MS

NMR

TLC

HPTLC

hvilke metoder kan brukes til kvalitetskontroll av solhattprodukter?

Det kan brukes mikroskopi, hvor man ser etter kjennetegn på solhattprodukter. Videre kan man bruke ulike analysemetoder for å identifisere innholdet i solhatt:

Kan bruke HPTLC eller GC:

HPTLC: Tar et ekstrakt av prøven på HPTLC platen sammen med referansestandard, med solhatt er det viktig å huske at man har flere typer solhattprodukter. Planten utvikles i et valgt løsemiddel og videre sprayes planten med et reagens og belyses med UV lys. Til slutt sammenlignes båndmønsteret med referansen

GC: Prøven ekstraheres i et organisk løsemiddel før det injiseres i GC. Stoffene separeres etter polaritet og det lages et kromatogram med spesifikke retensjonstider

I kvalitetskontroll vil det avdekkes stoffene som er i solhattekstraktet. Dersom vi er ute etter å se på innholdet av alkylamider så kan man finne ut dette via disse analyseteknikkene

referanseløsninger i HPTLC skal ha like egenskaper slik som det stoffet vi vil analysere, men det skal kunne skilles i analytiske teknikker. Disse brukes bare til sammenligning etter analysen er gjort.

Forskjell i regelverket dersom du markedsfører preparat som kosttilskudd istedenfor et plante basert lm?

kostilskudd: Reguleres som en matvare fra matilsynet

Ingen godkjenningsordning og produsent har selv ansvar for sikkerhet og kvalitet

Kan inneholde vitaminer, mineraler

Kan ikke påstå medisinsk effekt

Har heller ikke krav om dokumentasjon på effekt

Planebasert legemiddel: Reguleres av DMP

Må godkjennes før det kan selges

Må dokumentere kvalitet, sikkerhet og tradisjonell bruk

Kan påstå med medisnisk effekt

Hvordan gå fra til å identifisere vev i droge via mikroskopi?

1. Tar en liten del av drogen

2. Pulveriserer om nødvendig, hvertfall hvis det er store mengder av drogen

3. Finner et objektglass og tilsetter litt av drogen og noen få dråper kloralhydrat

4. Setter på dekkglass

5. Varmer forsiktet preparatet, og med engang du ser at det koker skal du fjerne det fra varmen. Det kommer av at varmen hjelper å fremskynde virkningen av kloralhydratet

6. Legges til å lufte, før man ser i mikroskopet

1. pulveriserer litt av drogen

2. Veier ut mengde som trengs av det pulveriserte ut ifra ph eur

3. Tilsettes vann som destilasjonsregaens

4. Tilsettes xylene fra røret

5. Destillasjon som fjernes etter 2 timer→ husk å fjerne mengde xylene brukt for å finne totalinnholdet

Ab: Spalteåpning i epidermis

Ad: Encellet nuppete/vortete dekkhår

Bb: Festet/Arret til dekkhår i epidermis

Ca: Parenkymceller med kalsiumoksalatkrystaller

Cc: Ledningsstreng

F: Fiberstruktur med enkeltkrystaller

Fa: Enkeltkrystaller av kalsiumoksalat

G: Encellet dekkhår sittende fast i epidermis

Ka: Celle i epidermis

A: Spalteåpninger i epidermis

B: Dekkhår sittende i epidermis

C: mesofyll med druser

D: Dekkhår sittende i epidermis. Spalteåpninger

Hva er lignifisert vev?

Vevet har cellevegger med lignin, et hardt og sterkt stoff som gir planten stivhet og styrke. Dermed er lignifisert vev et sterkt, motstandsdyktig og stivt vev i planter

Hva er herba?

Urt- de overjordiske delene av planten, altså stengel, blader og blomster

Oppbygning av blad?

1. Kutikula- Et tynt vokslag som beskytter mot fordamping og mekanisk skade

2. Epidermis- består av tette celler som danner en beskyttende overflate

3. Mesofyllet er midtvevet som består av Pallisadevev (Tettpakkede, sylindriske celler som har kloroplaster→ fotosyntese her) og svampevev (ligger under pallisadevevet, og består av løst ordende celler med store luftrom. Her skjer gassutveksling)

4. nedre epidermis- Spalteåpninger (stomata) for gassutveksling og hår (trikomerer) til beskyttelse eller utskilelse av sekret

Hva består spalteåpninger av?

To lukkeceller som styrer åpning/lukking for gassutveksling

hva er dekkhår?

Overflaten av epidermis

Består av ett eller flere celler som danner et hår. Har ingen kjertel eller sekretorisk del

Kan være:

• Enkle (rette, ugreinete)

• Forgrenede

• T-formede

• Stjerneformede (stellate)

• Krøllete eller bøyd

Funksjoner: beskytter mot fordampning, sterk sollys og mekanisk skade

Hva er kjertelhår?

Består av:

en stilkcelle som holder håret opp fra overflaten

et kjertelhode med sekretoriske celler som produserer og lagrer stoffer

Funksjonr: Skiller ut eller lagrer sekundære metabolitter som:

eteriske oljer, harper og slimstoffer

Beskytter planten kjemisk

Hva er kalsiumoksalatkrystaller?

Uoppløselige krystaller som dannes i planteceller pga metabolismen. Består av CaC2O4, og er et avfallsprodukt som planten bruker til å regulere kalsiumbalanse og er med på å beskytte slik at insekter ikke spiser planten

Typer:

Rafider- tynne nålformete krystaller

Prismatiske krystaller- firkantet eller sekskantet

Druser- kuleformede aggregater av små krystaller ser ut som stjerner

Sandkrystaller- mange små, partikler

Hva bør man forvente å se i mikroskop til de ulike drogene?

Rotdroge: Stor andel stivelsekorn. Stivelse finnes som opplagsnæring i planter. Man kan også se mye styrkevevsceller i form av stein celler og fibre, ledningsvev og kork samt parenkymceller (grunnvev som består av lite diffrensierte celler)

Blad: Mesofyllet som består av palisadevevet og svampevevet. Epidermis, kjertelhår, dekkhår, spalteåpninger i epidermis, kalsiumoksalatkrystaller og ledningsvev

Blomster: Pollenkorn, kjertelhår, kornbladfragmenter, epidermisceller

Bark: kork, kalsiumoksalatkrystaller, styrkevevsceller, noe stivelse

A: Blad

Drogen består av blader. Dette ses på grunn av tilstedeværelse av epidermis m/stripte kutikula (A), kjertelhår (B og D), spalteåpninger (Ca) i epidermis (C), kalsiumoksalatkrystaller i parenkymceller (krystallsand), del av mesofyllet (E), dekkhår (F) og ledningsvev (K). Spalteåpninger er små åpninger som finnes i epidermis i de fleste blader, og det er her gassutvekslingen mellom blad og atmosfære skjer. Dekkhår sitter festet i over- og eller underhuden (epidermis) på bladene. Mesofyllet er det fotosyntetiserende vevet i bladene. Aa = parenkymcelle

B:

Drogen er en rotdroge. Dette ses på grunn av tilstedeværelse av stivelseskorn (A), styrkevevsceller (sklerenkymceller) i form av sklerider/steinceller (D) og fibre (H), trakeider/ledningsvev (E), kork (Ba). Drogen inneholder også kalsiumoksalatkrystaller i form av rafider (Bc og Gb). Drogen er brekkrot, og var inkludert i mikroskopikurset.

Hvorfor brukes sprayreagens?

Det gjøres for å gjøre forbindelsene mer synlige på platen, for å gjøre identifikasjonen lettere for stoffene

hvorfor standardiseres ekstrakter for innhold av bestemte kjemiske innholdsstoffer?

Gjør det enklere å analysere innholdet i ekstraktet og sikrer dermed lik styrke mellom hver batch

Uten standardisering kan samme dose gi forskjellig effekt

c)

Stivelse finnes i lagerstoff inni plantecellene og lagres i amyloplaster

Typisk i rot

Cellulose er som et strukturelt byggestoff og utgjør hoveddelen av plantecelleveggen

Typisk i blad

d)

Tar litt droge på dekkglasset og noen få dråper Kaliumjodid på drogen

Se under mikroskopet hvor stivelse vil være farget blå-svart

Det kan være greit å se på preparatet først uten stivelse også etter for å se etter endringer

Hva er et flytende ekstrakt

Konsentrert planteekstrakt i væskeform, der virkestoffene er ekstrahert med et løsemiddel

Brukes i miksturer