1) Princip fluorescence, fluorochromy, vnitřní a vnější fluorescence

„Viditelné“ světlo

• elektromagnetické vlnění o vlnové délce 400 - 700 nm

• elementární částice = foton - představuje kvantum elektromagnetické energie (světla)

• duální povaha - vlnová i částicová (dle metody studia)

vlnová délka (λ)

délka jednoho kmitu (400-700 nm)

frekvence (f)

počet kmitů za sekundu (4-81014 s-1 [Hz])

Vztah mezi vlnovou délkou a frekvencí:

• c=λf

• f=c/λ

• λ=c/f

• rychlost světla je konstantní

energie fotonu:

• E=hf

• E=hc/λ

• rychlost světla konstantní

• Planckova konstanta: h = 6,62610-34 Js

Rychlost světla (c)

• c = 300.000 km*s-1

• konstantní ve vakuu

• snížení rychlosti -> zkrácení vl. délky

• definice metru v SI - 299 792 458 m/s

vlivy na barvu světla

• frekvence stejná -> barva stejná

• vlnová délka → barva

• amplituda → jas

• vlnová délka ~ barva světla

300nm - 400 nm

ultrafialová

400 nm - 500 nm

fialová - modrá - zelená

500 nm - 600 nm

zelená - žlutá - oranžová

600 nm - 700 nm

oranžová - červená

700 nm - 800 nm

infračervená

LUMINISCENCE

jev při kterém vysílá látka do prostoru světlo

dělení luminiscence dle indukce

chemiluminiscence vs. fotoluminiscence

chemiluminiscence

• vyvoláno chemickou reakcí

• např. oxidace luciferinu luciferázou u světlušky,

• tlející dřevo – václavka, ECL detekční činidlo pro western blotting

Fotoluminiscence

záření je vyvoláno jiným zářením

Fotoluminiscence se dále dělí na

• a) fluorescence

• b) fosforescence

fluorochrom

= fluorofor, látka schopná fluorescence

excitační záření

luminiscenci vyvolává

emisní záření

vysílané látkou

Podstata fluorescence

Excitace a emise, Jablonskiho diagram

Průběh fluorescence

1. excitace elektronů fotony ze základní energetické hladiny do excitovaného stavu trvání 10-15 s

2. excitovaný stav pokles na nejnižší hladinu excitace (relaxace) ztráta energie ve formě tepla, trvání 10-14 – 10-11 s

3. emise světla => fluorescence, trvání 10-7 – 10-9 s = doba dohasínání

photobleaching

degradační proces barviv vystavených intenzivnímu světlu, vedoucí k jejich oslabení nebo ztrátě fluorescenčních vlastností.

fosforescence

Doba, během které excitované molekuly vydávají světlo po energizaci, trvá déle než fluorescence, často v řádech mikrosekund až hodin.i.e. doba dohasínání 10-3 – 102 s

excitovaný singletový stav

• elektrony obsazují vyšší energetické hladiny

• porušuje se párování elektronů

• na jednotlivých hladinách

• spin se při excitaci nemění

základní singletový stav

• všechny elektrony jsou spárovány

• mají opačný spin

• velikost +1/2, -1/2

tripletový stav (zakázaný)

• méně pravděpodobný

• elektrony mají stejný spin

Spin

je kvantová vlastnost elementárních částic - vnitřní moment hybnosti částice. Spiny částic přispívají k celkovému momentu hybnosti soustavy.

Stokesův posun

• Vlnová délka excitujícího světla je menší než emitovaného (λex< λem)

• Energie excitujícího světla je větší než emitovaného (Eex> Eem)

• V rámci relaxace v excitovaných stavech dochází ke ztrátě energie

fluorochromy charakterizuje

Absorbční (excitační) a emisní spektrum, Molární extinkční koeficient (molární absorptivita), Kvantový výtěžek fluorescence (Qantum Yield = QY)

Absorbční (excitační ) spektrum

závislost intenzity fluorescence na excitační vlnové délce (měřeno při konstatní emisní vlnové délce)

Emisní spektrum

závislost intenzity fluorescence na vlnové délce při konstantní vlnové délce excitace

vztah absorpčního a emisního spektra

• obě spektra mají své maxima

• vzdálenost mezi nimi – Stokesův posun

Emisní spektrum určitého fluorochromu

• je nezávislé na vlnové délce excitace

• emise z nejnižšího excitovaného stavu (S1)

• mění se pouze intenzita fluorescence

• intenzita emisního spektra odpovídá amplitudě excitace

Symetrie mezi absorpčním a emisním spektrem

- struktura vibračních hladin základního i excitovaných stavů je stejná

- absorpce (excitace) a emise do odpovídajících hladin nastává se stejnou pravděpodobností

- absorpční a emisní spektra zrcadlově symetrická

Molární extinkční koeficient (molární absorptivita)

• vyjadřuje míru schopnosti látky absorbovat světlo

• Lambert-Beerův zákon

• A = - log I / I0 = log I0/I = ɛ · c · l

  • A – absorbance (bez jednotek)

  • I / I0 – transmitance (T, propustnost)

  • ɛ – molární extinkční koeficient (l·mol-1·cm-1)

  • c – molární koncentrace (mol·l-1)

  • l – dráha (cm)Kvantový výtěžek fluorescence (Qantum Yield = QY)

Kvantový výtěžek fluorescence (Qantum Yield = QY)

• QY = počet emitovaných fotonů / počet absorbovaných fotonů

• vyjadřuje míru schopnosti excitačního vlnění vyvolat fluorescenci

• maximálně = 1 (teoreticky; energetické ztráty)

struktura fluorochromů

• často obsahuje polycyklické nenasycené sloučeniny a atomy

  • (s více elektrony – např. P, S)

• čím více benzenových jader, tím více roste absopční maximum

  • benzen 262 nm

  • naftalen 272 nm

  • antracen 375nm

  • tetracen 475nm

  • pentacen 580nm

Fluorescence látek a skupiny fluoroforů může být

Vlastní (vnitřní) nebo Nevlastní (vnější)

Vlastní (vnitřní) fluorescence látek

• Přirozeně se vyskytující fluorofory/fluorochromy

• aminokyseliny, kofaktory enzymů, chlorofyl, „přírodní“ fluorescenční proteiny (green fluorescent protein,…)

Nevlastní (vnější) fluorescence látek

liší se podle přímé nebo nepřímé vazby fluorochromu

Přímá vazba fluorochromu

• na molekuly nebo buněčné struktury

  • použití sondy -> označení DNA, buněčné stěny, plazmatických membrán, organel…

  • detekce mitochondriální aktivity - respiračního vzplanutí, koncentrace H+ (pH indikátory), membránový potenciál..

Nepřímá vazba fluorochromu

• použití značky

• navázání na imunoglobulin (protilátku) nebo úsek nukleové kyseliny, phalloidin, annexin V… -> následné označení buněčné struktury

aminokyseliny jako přirozené fluorofory

• tryptophan, tyrosine, phenylalanin

• hlavní zdroj fluorescence proteinů v UV spektru

• indolová skupina Trp

• Trp v sekvencích jen 1%

• metabolicky náročná syntéza

kofaktory jako přirozené fluorofory

• Nikotinamid adenin dinukleotid (NADH)

• Flavin adenin dinukleotid (FAD)

• NAD+ není fluorescenční - fluorochrom = redukovaný nikotinamidový ring

• chlorofyl

chlorofyl

• porfyrinové jádro + Mg

• Stokesův posun až 200nm

• využití:

  • hodnocení výskytu fytoplanktonu ve vodě

  • studium fotosyntézy

  • fyziologický stav rostlin – stres (pokles fl.)

Nevlastní (vnější) fluorescence - charakteristika

• značky jsou vázány k molekulám (proteiny, peptidy,

  oligonukleotidy..) kovalentní vazbou

• proteiny – vazba na aminové (NH2-), thiolové (SH-) skupiny nebo histidinové řetězce

požadavky pro nevlastní fluorescenci

• vysoká intenzita fluorescence

• stabilita při ozařování

• minimální vliv na biologické vlastnosti vzorku

značky mohou být

Rhodaminy, Fluorescein isothiocyanate (FITC), Cy značky (Cyanine dyes), Alexa Fluor Dyes (Molecular Probes)

Rhodaminy

• historicky nejpoužívanější fluorescenční značky

• převážně na protilátky

• ve formě derivátů

• vysoký kvantový výtěžek 0,3-0,8

• photobleaching

• tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC)

  • ex. – 541nm, em. – 572nm

Fluorescein isothiocyanate (FITC)

ex. - 495 nm, em. - 521 nm

Cy značky (Cyanine dyes)

• zástupci Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7

• částečně nasycené heterocykly + další aromatická jádra

• ex. a em. spektra podobná klasickým fluoroforům

• kratší Stokesův posun (∼30nm)

• fotostabilní

• vyšší kvantový výtěžek

Alexa Fluor Dyes (Molecular Probes)

• sulfonovaný derivát rhodaminu

• vyšší kvantový výtěžek  svítivost

• zesílená fotostabilita (↓photobleaching)

• pH stabilita

• dlouhodobě stabilní

• využití – živé buňky, tkáňové řezy, fixované preparáty

• great variety of exc. a em. maxim

• označení podle vlnové délky zdroje excitačního záření

Fotostabilita fluorochromů

• v každý fluorofor podléhá vysvícení v průběhu souvislého osvětlení

• ve FM silná intenzita dopadajícího záření

• nejstabilnější – značky Alexa Fluor

• není znám princip předpovědi stability dle struktury

Quantum dots

• florofory (značky) = po absorbci fotonů emitují

• světlo o větší vlnové délce

• anorganické nanokrystaly

• velikost 10-20nm (GFP 4,2 x 2,4 nm)

složení quantum dots

• jádro: několik 100x-1000x molekul polovodičového materiálu (Cd, Se, Te)

• obal: polovodič (ZnS), stabilizuje jádro, zlepšuje optické a fyzikální vlastnosti

• plášť: amfifilní polymer, umožňuje vazbu dalších molekul

• vnější plášť: polyethylene glycol (PEG) – snižuje nespecifickou vazbu

Vlastnosti quantum dots

• vlnová délka emise závisí na velikosti částice

• umožňují vícebarevnou detekci jedním excitačním zdrojem

• možnost konjugace s primárními i sekundárními protilátkami nebo streptavidinem

• více molekul IgG na jednu částici

• vyšší jas než klasické fluorofory

• násobně vyšší stabilita

• velký Stokesův shift

vazba QD na protilátku – srovnání s „klasickým“ konjugátem