Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y qPCR

Flashcards sobre los principios y aplicaciones de PCR y qPCR.

¿Qué es la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y qué componentes necesita?

Una técnica de biología molecular que amplifica una secuencia de ADN específica. Requiere iniciadores, cebadores, Taq polimerasa, ADN templado, cloruro de magnesio, buffer 10x, deoxinucleótidos (dNTPs) y agua destilada estéril.

¿Qué se muestra en el eje x del gráfico que representa la PCR?

El ciclo de tiempo.

¿Cuáles son los tres pasos en un ciclo de PCR?

Desnaturalización del ADN, anillamiento de los primers y elongación de los primers.

¿Cuál es la fórmula para calcular el número de copias de ADN después de n ciclos en PCR?

Nn = No x 2n, donde Nn es el número de copias después del ciclo n, No es el número de copias iniciales y n es el número de ciclos.

¿De dónde se obtiene la ADN polimerasa (Taq polimerasa) utilizada en PCR?

Thermus aquaticus y su ADN polimerasa. Es una bacteria termofílica.

¿Cuál es la función del Cloruro de Magnesio (MgCl2) en la PCR?

Es un cofactor crucial para la amplificación. Su concentración afecta la actividad de la enzima y la fidelidad de la polimerasa.

¿Qué es la procesividad de las polimerasas?

Es el número de nucleótidos añadidos antes de que la polimerasa se libere del sustrato.

¿Cuáles son algunas variantes de la PCR?

PCR endpoint, PCR multiplex, RT-PCR (retro-transcriptasa) y qPCR (PCR cuantitativa).

¿Cuál es una aplicación del PCR multiplex?

Identificación de Listeria monocytogenes y sus serotipos.

¿Qué organismo es estudiado en el contexto de RT-PCR en las notas?

Los caracoles tienen Schistosoma mansoni.

¿Cuál es la diferencia entre qPCR y PCR tradicional?

En la PCR tradicional, la detección se realiza al final del proceso (endpoint), mientras que la qPCR permite la cuantificación en tiempo real durante la amplificación.

¿Qué se mide en qPCR?

Detección y cuantificación de fluorescencia emitida por una molécula reportera fluorescente.

¿Qué es el Ct (Ciclo umbral) en qPCR?

El ciclo en el cual la fluorescencia aumenta significativamente con respecto a la línea base.

¿Cuáles son los tipos de moléculas reporteras fluorescentes usadas en qPCR?

Colorantes de unión a doble cadena (ej. SYBR Green) y sondas (de hibridación) como TaqMan.

¿Cómo funciona SYBR Green en qPCR?

Se une al surco menor del ADN y emite luz cuando está unido al ADN de doble cadena.

¿Qué es la fluorescencia?

Es la emisión de luz por una sustancia que absorbió luz o radiación electromagnética.

¿Cuál es el templado usado en qPCR y qRT-PCR?

qPCR usa ADN genómico (gDNA) como templado, mientras que qRT-PCR usa cDNA como templado.

¿Qué es una curva de melting o disociación en qPCR?

Es una gráfica del cambio de fluorescencia observado cuando el ADN de doble cadena se disocia o desnaturaliza a ADN de cadena sencilla a medida que la temperatura aumenta.

¿Cuáles son las razones para obtener malas curvas de melting en qPCR?

Mal diseño de los primers, contaminación con ADN genómico (exceso), dímeros de primer.

¿Qué actividad realiza el clivaje de la sonda TaqMan?

La actividad exonucleasa.

¿Qué indica los Ct bajos en qPCR?

Altos niveles del material inicial del ADN molde.

¿Qué requiere una cuantificación del Ct en qPCR?

La determinación de la curva estándar (de cantidad de ADN molde).

¿En la cuantificación relativa, con qué se compara los niveles de expresión en el tratamiento.

Se normaliza contra la cantidad de ARN inicial. Se compara con relación a un gen de referencia (housekeeping).

¿Cuáles son algunas aplicaciones de la qPCR?

Expresión genética, genotipificación de SNPs, discriminación de alelos, análisis de mutaciones somáticas, detección de número de copias de un gen, detección de metilación, detección y cuantificación de patógenos, cuantificación de carga viral.

¿Cuáles son algunos genes blancos para diagnóstico de COVID19?

ORF1ab, N, RdRP, E.

¿Qué genes se utiliza en el ensayo multiplex para COVID 19?

N1, N2, RP, ORF1ab, S, MS2.