kolejna biochemia

jakie zjawisko wykorzystuje się w metodach spektrofotometrycznych

zjawisko pochłaniania = selektywnej absorpcji promieniowania, bo każda sub pochłania w określony sposób kwant promieniowania w zakresie widma elektromagnetycznego

jaką długość fali ma promienie gamma

poniżej 10 pm

jaką długość fali ma promieniowanie X

10pm-10nm

jaką długość fali ma promieniowanie ultrafioletowe (dalekie)

10-200nm

jaką długość fali ma promieniowanie ultrafioletowe (bliskie)

200-390nm

jaką długość fali ma światło widzialne

390-800nm

jaką długość fali ma promieniowanie podczerwone

800nm - 1mm

jaką długość fali mają mikrofale

1nm - 30 cm

podział SPEKTROFOTOMETRIA ABSORPCYJNA

• spektrofotometria kolometryczna (w świetle widzialnym)

• absorpcjometrię w nadfiolecie (=ultrafiolecie)

• absorpcjometrię w podczerwieni

VIS

absorpcjometria w zakresie światła widzialnego

UV

absorpcjometria w zakresie bliskiego ultrafioletu

od czego zależy długość fali

• od ilości i rozmieszczenia elektronów

wzbudzenie cząsteczki

to przeniesienie elektronów na wyższy poziom energrtyczny

absorbancja (A) to inaczej

enkstynkcja (E)

prawo Lamberta-Beera

określa zależność pomiędzy natężeniem promieniowania padającego na roztwór danego związku (Io) a natężeniem promieniowania przechodzącego (I) przez warstwę badanej próbki

wzór na absorbancję

A = log (Io / I) = kcl

I_o

natężenie światła monochromatycznego o określonej długości fali padającego na roztwór

I

natężenie światła po przejściu przez roztwór

k

współczynnik absorbancji właściwej dla danej długości fali

k to wielkość charakterystyczna dla

• dla danej substancji (niezależna od jej stężenia) i

• rozpuszczalnika dla danej długości fali

absorbancja jest liczbowo równa

stężeniu 1 mol/l i grubości warstwy l = 1 cm

c

stężenie danego związku (mol/l)

l (kcl)

grubość warstwy absorbującej, standardowo l = 1 cm, gdyż w badaniach biochemicznych grubość stosowanych kuwet wynosi zwykle 1 cm

co określa barwę

grubość warstwy absorbującej, standardowo l = 1 cm, gdyż w badaniach biochemicznych grubość stosowanych kuwet wynosi zwykle 1 cm

Gdy zakres długości fal promieniowania absorbowanego przez dany związek jest dostatecznie wąski, to

związek ten ma barwę dopełniającą do barwy absorbowanego promieniowania

czy związki bezbarwne pochłaniają fale w widzialnym obszarze widma

nieeee

a co pochłaniają związki czarne

pochłaniają wszystkie długości fal

co umożliwia nam znajomość widma absorpcyjnego badanego związku

umożliwia oznaczenie jego stężenia/ilości w roztworze

Stężenie badanej substancji w roztworze można obliczyć:

• korzystając bezpośrednio z prawa Lamberta-Beera

• stosując krzywą kalibracyjną (wzorcową, standardową)

jakie aminokwasy absorbują światło nadfioletowe powyżej 240nm

• Trp

• Tyr

• Phe

czy aminokwasy są bezbarwne

taak, bo nie absorbują światła widzialnego i ultrafioletowego z wyjątkami

jakie światło absorbują białka

światło nadfioletowe w paśmie 260-290 nm, zawdzięczają to aminokwasom aromatycznym

przy jakiej dlugości fali trp i tyr wykazują maksimum absorbancji

280 nm i w tedy dokonuje się ogólnie odczytu absorbancji białka

czy ilość zaabsorbowanego światła jest proporcjonalna do ilości białka

raczej tak ale trp i tyr lubi namieszać

czy tylko aminokwasy absorbują w zakresie światła UV

nie, bo też k. nukleinowe i nukleotydy

k. nukleinowe i nukleotydy jakie mają maksimum absorbancji

260nm

Metoda Bradford

W środowisku kwaśnym (w roztworze H3PO4) CBB przyjmuje zabarwienie

brunatną

(EDTA)

wersenianu sodu

wada Metod Bradforda

wiązanie barwnika przez różne białka, a ponadto fakt, że aceton, siarczan dodecylu sodu (SDS) i Triton X-100 dają w połączeniu z barwnikiem dodatkowy interferujący kolor, co zwiększa natężenie barwy niebieskiej i przeszkadza w uzyskaniu wiarygodnych wyników

buforki

wersenianu sodu (EDTA), jonów magnezu, sacharozy, glikolu i związków tiolowych

jakie reszty aminokwasów wiążą barwnik CBB

reszty argininy, a w minimalnym stopniu również reszty histydyny, lizyny, proliny, tryptofanu i tyrozyny

CBB

barwnika Coomassie Brilliant Blue G-250

co się stanie gdy dodamy CBB do roztworu

powoduje powstawanie kompleksu o intensywnie niebieskim zabarwieniu i przesunięcie maksimum absorbancji barwnika z 465 nm do 595 nm.

CBB występuje w 2 formach

• brunatna w wolnym roztworze

• niebieska → jak zwiąże się z białkiem

Metoda z kwasem bis-cynchoninowym (BCA)

Jest to test na obecność wiązania peptydowego (min 2), szczególnie w peptydach i białkach

W reakcji biuretowej do roztworu analizowanej mieszaniny zostają dodane

silna zasada oraz siarczan miedzi(II). W środowisku zasadowym dochodzi do tautomeryzacji wiązania peptydowego z utworzeniem formy enolowej. Z ugrupowaniami tego typu jony miedzi tworzą dwa wiązania z atomami tlenu grup enolowych oraz cztery wiązania z atomami azotu, co powoduje powstanie fioletowo-niebieskiego kompleksu (Ryc. 2), który maksimum absorbancji posiada przy długości fali 546 nm. Nasilenie barwy tego kompleksu zależy od długości (ilości wiązań peptydowych) łańcucha peptydowego, a więc jest proporcjonalne do stężenia białka.

Zasada metody z BCA

• metoda oznaczania białek oparta na reakcji biuretowej

co się dzieje w środowisku alkalicznym podczas używania metody BCA

• reszty niektórych aminokwasów obecnych w białkach, takich jak tyrozyna, tryptofan, cysteina oraz cystyna, powodują redukcję jonów Cu2+ do jonów Cu+, które to z kolei tworzą z kwasem bis-cynchinonowym stabilny barwny kompleks.

• Jego maksimum absorbancji przypada przy długości fali 562 nm.

Metoda mikrobiuretowa

Dzięki zastosowaniu spektrofotometrycznego pomiaru absorbancji fiołkowego kompleksu powstającego na skutek reakcji jonów miedzi w środowisku zasadowym z wiązaniami peptydowymi, przy długości fali 310 nm

50-krotny wzrost czułości oryginalnej metody biuretowej

Dodatkowo, opcjonalne traktowanie oznaczanej próby 0,5 M roztworem NaOH zamiast wody, umożliwia oznaczenie zawartości białka w płynach biologicznych, homogenatach komórkowych czy frakcjach subkomórkowych.