F8 Protein purification in drug development

hur utvecklar man ett nytt läkemedel?

• medicinsk behov

• konkurrens

• IP situation (patent)

• vilket mål ska strävas efter

• validering av målet

• protein eller liten molekyl? proteinrening behövs i båda

• terapeutiskt protein

  • förlängt halvliv (PEGylation, fusion proteiner)

  • undvik immunogenicitet

  • ökande stabilitet

visa läkemedels utvecklings provessen

vad är skillnaden på phase I och phase II/III

i phase I handlar det om säkerhet, i senare faser handlar det mer kring patient och sjukdom dvs om den går att bota

hur används proteinproduktion i forskning och utveckling?

• molekylär biologi

• expression screening

• odling

• rening

• karakterisering/analys

visa bild över delarna i “expressibility” of the protein

Vilka frågor ska man ställa vid “expressibility” av proteinet

• protein lokalisering

• uttryck full-längd eller domäns?

• hur ska man bevara aktivitet

• protein modifiering

• kouttryck?

• protein stabilitet

• halv liv in vivo?

• mängd?

visa bild över delarna i expression screening

vad tänker man på vid konstrukt strategi?

otaggad eller taggad?

• rening

• detektion

• lösningshet

• reducera proteolytisk aktivitet

• ökande uttryck nivåer

• förlängd halv tid

fusions partners

• His-tag, GST, MBP, ST(II), FLAG, Z, IgG-Fc, Albumin

Klyvning

• PreScission (3C proteas)

• TEV

• Thrombin

Hur sker lysering?

E.coli

• sonikering

• high pressure homogenization

• lysozym

• detergent

Yeast

• bead mill

• lyticase/zymolase

Insekt-/mammaliaceller

• mixer

• detergent

• sonikering

• dounce tissue grinder

Vad har IMAC för tagg/fusionspartner?

His-tag

Vad har glutathion för tagg/fusionspartner?

GST

Vad har concanavalin A för tagg/fusionspartner?

glycoproteins

Vad har strep tactin för tagg/fusionspartner?

Strep-tag II

Vad har anti-FLAG för tagg/fusionspartner?

FLAG-tag

Vad har amylos/dextrin för tagg/fusionspartner?

MBP

Vad har protein A/protein G för tagg/fusionspartner?

antikropp

Vad har IgG för tagg/fusionspartner?

Z-domän

Vad har blue sepharose för tagg/fusionspartner?

albumin

hur fungerar IMAC = Ni2+ sepharose (affinitets kromatografi)

• 6/10 histidiner binder till immobiliserat Ni2+

• eluerar med imidazol, stegvis eller gradient

• ph 5.5-8.5

• compatibel med 8M urea/6M GuaHCl (detergenter, reducerande agenter)

• 20-50 mM imidazole i start buffert för att ta bort ospecifik bindning

• 40 mg målprotein/ml Ni sepharose

• max laddning => högre renhet

• can användas för “on-column cleavage”

• regererering med 1M NaOH

vad har lågt pI?

Kontaminanter: E.coli proteiner, DNA och endotoxiner

Visa en titrerings kurva

vad kan man göra för att rena ett protein bättre om man har laddat för mycket protein på kolonnen

ändra till en smal och hög kolonn

vad kan hängande band på SDS page bero på

ev protein i bakgrunden

vad används en titrerings kurva för?

att välja buffer pH

hur gör man ett bra buffertbyte

1:5 spädning x 3 gånger = 125 spädning => 0,8% kvar av tidigare buffert

varför ska man förvara proteinet i -70°C istället för -20°C

vid -20°C bildas kristaller

hur optimerar man reningen

det sker förluster i varje steg, ha därför så få steg som möjligt för att det ska bli rent

vad finns det för typer av filtrering

• membranfilter - specifik porstorlek

• djupfilter - nominal partikelstorlek

• TFF (UF/DF) - specifik porstorlek, tangential flow filtration (ultrafiltrering/diafiltrering)

hur kan man förlänge halv-livet

med PEGylation

vad ingår i kvalitetsarbetet

• SOP = standard operating procedure

• GLP = good laboratory practice

• GCP = good clinical practice

• GMP = good manufacturing practice

Förklara GLP

GLP = good laboratory practice

Handlar om organisationen, processer och villkor under vilka laborativa studier är planerade, utförda, kontrollerade, dokumenterade och reporterade. GLP praktik är menade att främja kvalitet och validitet av test data

Förklara GCP

GCP = Good clinical practice

Internationell etiskt och vetenskaplig kvalitets standard för design, genomförande, dokumentation och reportering prövningar som involverar deltagande av försökspersoner. Efterlevnad av denna standard ger allmänheten försäkran om att försökspersonernas rättigheter, säkerhet och välbefinnande skyddas i enligt med principer som härrör från Helsingforsdeklarationer, samt att uppgifterna från den kliniska prövningen är trovärdiga.

Förklara GMP

GMP = Good manifacturing practice

Syftet med GMP är att säkerställa att säkra och effektiva produkter konsekvens tillverkas och kontrolleras enligt kvalitetskrav som är lämpliga för den avsedda användningen. GMP-riktlinjerna beskriver hur läkemedelstillverkning ska utföras samt hur anläggningar bör utformas och stödsystem konstrueras.

Vilka punkter tar GMP riktlinjer hand om

• kvalitetsenhetens ansvarsområden

• organisation och personal

• byggnader och lokaler

• processutrustning

• dokumentation och register

• material

• produktion och processkontroller

• laboratoriekontroller

• validering

• avvikelser

• ändringshantering

• reklamationer och återkallelser

vad gäller för personal vid GMP riktlinjer

• kvalificerad personal med lämplig utbildning, träning och erfarenhet för att utföra arbetet

• rena kläder samt skydd för huvud, ansikte, händer och armar vid behov

• personalen bör tillämpa god hygien och hälsosamma vanor

• personal med smittsam sjukdom bör inte arbeta i GMP-anläggningen

• upprätta standardrutiner (SOP:er) för olika moment

vad gäller för byggnader och anläggningar vid GMP riktlinjer

• utformning

• belysning, avloppssystem, avfallshantering, sanitet

• vatten, gas, ånga, tryckluft, ventilation, luftkonditionering mm

• flöden i anläggningen (för att undvika sammanblandning och kontaminering):

  • personal

  • produkt

  • material

  • rena och smutsiga redskap

  • avfallshantering

• analys av partiklar, mikroorganismer

• upprätta standardrutiner (SOP:er)

vad gäller för processutrustning vid GMP ritklinjer

• Kromatografisystem. Vilka typer?

• Hur många?

• Vad ska ingå?

• Antal ventiler, monitorer, luftavskiljare, pump, kapacitet, mjukvara

• Hur stora kolonner?

• Vilka typer av kolonner?

• pH-mätare

• Vågar

• Kylskåp, kylrum?

• Omrörare

• LAF-bänkar?

• Filtreringsutrustning

• Upprätta SOP:ar

vad gäller för kvalificering av utrustning och anläggningar

Designkvalificering DQ

• Dokumenterad verifiering av att den föreslagna designen av anläggningar, utrustning eller system är lämplig för det avsedda ändamålet

Installationskvalificering IQ

• Dokumenterad verifiering av att utrustningen eller systemen, som installerade eller modifierade, överensstämmer med den godkända designen, tillverkarens rekommendationer och/eller användar krav

Driftskvalificering OQ

• Dokumenterad verifiering av att utrustningen eller systemen, som installerade eller modifierade, fungerar som avsett inom de förväntade driftsområdena

Prestandakvalificering PQ

• Dokumenterad verifiering av att utrustningen och hjälpsystemen, som anslutna tillsammans, kan fungera effektivt och reproducerbart baserat på den godkända process metoden och specifikationerna

vad gäller för processvalidering?

Processvalidering (PV)

• Dokumenterade belägg för att processen, när den körs inom fastställda parametrar, fungerar effektivt och reproducerbart för att framställa en mellanprodukt eller en aktiv substans (API) som uppfyller förutbestämda specifikationer och kvalitetsegenskaper.

Validering av rengöring

• Dokumenterad verifiering av lämpliga rengöringsförfaranden.

• Provtagningen bör omfatta både avstrykning och sköljning.

• Verifiera att överföringen batch-to-batch minimeras.

Validering av analysmetoder

Rapporter för kvalificering och validering ska upprättas och godkännas.

vad gäller vid dokumentering?

Kvalificerings- och valideringsrapporter

• Godkända rapporter för all utrustning och alla anläggningar

SOP:er

• Metodbeskrivningar ska upprättas för alla förfaranden som ingår i eller stöder tillverkningen, t.ex. kalibrering, rengöring, analys och provtagning

Batch dokumentation

• Ett godkänt protokoll för satstillverkning med fastställda gränsvärden ska följas under hela tillverkningen av batch.

Avvikelser/OOS (utanför specifikation)

• Rapporter om avvikelser eller OOS ska ingå i satsdokumentationen före frisläppande.

IND-ansökan (prövningsläkemedel)

• Rapporter till myndigheter med ansökan om att påbörja kliniska prövningar på människor

visa bild över SOP

visa bild över batch record (batch protokoll)

Visa ex på IPC

vad betyder IPC

in process controls

hur sker inspektion av myndigheter?

• En inspektör från Läkemedelsverket, EMA eller FDA kommer att granska tillverkningen av en aktiv läkemedelssubstans (API) samt gå igenom rutiner och dokumentation.

• Vid inspektionen granskas kvalitetssystem, organisation och personal, lokaler, laboratorier, utrustning och dokument.

vad betyder cGMP?

current GMP