geavanceerde chemische analyse, -beeldvorming en -verwerking

H/E kleuring

Haematoxyline: kleurt basofiele componenten, nucleïnezuren (donkerblauw)
Eosine: kleurt eosinofiele/acidofiele componenten, NH2 groepen van EWn (roze)
→ lichmicroscopische analyse (bright field)

PAS kleuring

periodic acid Schiff, kleuring darmvillus → vrije suikers

soorten lichtmicroscopie

• bright field microscopie

• fasecontrast microscopie

• fluorescentiemicroscopie

lichtmicroscopen voor levende cellen

• fasecontrast microscopie: obv faseverschuiving van licht en ± interferentie

• differentiële interferentie-contrastmicroscopie (DIC): obv pos/neg interferentie van gepolariseerd licht

• digitale microscopie: computerverwerking van beelden met gevoelige videocamera’s

• donkerveldmicroscopie: bacteriën en organellen

• (fluorescentie)microscopie: life cell

verschillen contrast bij LM

• gekleurd: kleuring verlaagt amplitude van golflengte van licht → kleurvorming

• geen kleuring: kleine verschillen in optische dichtheid → gebruiken om beeldcontrast te maken: cellen en organellen hebben afwijkende brekingsindex waardoor er een faseverschuiving van het licht is en met interferentie wordt dit tot een zwart-wit beeld herleid (fasecontrast of DIC)

fluorescentiemicroscopie

fluorochroom laten exciteren dat licht uitzendt

• epi-fluorescentie: activatie met licht met een korte golflengte waardoor fluorochrome stof in preparaat licht met een langere golflengte uitzendt

  → conventioneel: kwikdamplamp als excitator

  → confocale laser scanning: laser als exciterende lichtbron

→ moln in cellen aankleuren en kwantificeren

meest gebruikte illuminatiesysteem fluorescentiemicroscopie

= epi-illuminatie

immunofluorescentie

eiwitten kleuren waaraan AL hangt waaraan een fluorochroom hangt

tagging EWn

EWn taggen met fluorescentie EWn om zo specifieke EWn te detecteren in levende cellen

nanopartikels

fluorescerende deeltjes vervaardigd uit halfgeleidermateriaal, knn worden gecoat, de grootte bepaalt de kleur
→ aanslaan met een blauwe laser
→ excitatiespectra is heel smal en overlappen dus niet tss de verschillende deeltjes (is een nadeel bij fluorochromen)

flourofoor

deel molecule dat zorgt voor fluorescentie

chromofoor

bepaalt kleur fluorescentie

confocale laser scanning microscopie

alleen een bepaalt focaal vlak bekijken, er is een pinhole dat belet dat emissielicht van boven of onder het gewenst focale vlak de detector bereikt

4D live cell imagine

combinatie van 3D multi kleur beeldvorming en time lapse opnames

elektronenmicroscopie

in een hoog-vacuüm ruimte wordt filament verhit en genereerd die een elektronenbundel die dan naar een anode wordt getrokken
→ beeldvorming: densere structuren absorberen elektronen en minder densere laten ze door

soorten elektronenmicroscopie

• transmissie EM: elektronenverstrooiing op zware atoomkernen in ultradun preparaat
  → probleem met kronkelende buis omdat je het interpreteert als secties door meerdere buizen

• scanning EM: dikker preparaat afscannen met elektronenbundel waarbij terugkaatsing van elektronen optreedt en generatie van sec elektronen

shadow casting

schuine bestuiving met verdampt metaal

speciale EM technieken

• vries-breek: membraanstructuren, diepgekoeld mes gebruiken dat cellulaire membranen tss binnen- en buitenblad breekt

• vries-ets: diepgekoeld mes gebruiken dat cellulaire membranen tss binnen- en buitenblad breekt, meer 3D-structuur

• cryo-elektron tomografie: 3D constructie object obv een serie van 2D projecties

preparatie materiaal

1. fixeren

2. dehydrateren

3. inbedden: weefsel te dik om licht/elektronen door te laten of te zacht

4. snijden

5. kleuren/contrasteren: als er te weinig contrast is

1. fixeren

doden weefsel met behouden van oorspronkelijke structuur, stilleggen autolytische en bacteriële afbraakreacties
→ membraan permeabiliseren, harder en poreuzer maken van weefsel, geen verlies van kleine moln (kleuring)
→ chemisch (in fixatief) of fysisch (invriezen)

chemische fixatie

• vernettende fixatieven = cross-linking: formaldehyde, glutaraldehyde, OsSO4

• precipiterende fixatieven: alcohol, aceton

formaldehyde

• polymerisatie tgn gaan

• reageert met verschillende delen EWn

• vooral bij LM

glutaraldehyde

• reageert met aminogroepen van EWn

• kan aan meerdere EWn tegelijk binden dus betere cross-linker

• betere morfologie, maar minder goed voor immuuncytochemie

• vooral bij EM (dubbele fixatie dus ook met OsO4)

OsO4

• oxiderend en cross-linker

• goeie binding met lipiden

• vooral bij EM (dubbele fixatie dus ook met glutaraldehyde)

factoren die rol spelen tijdens fixatie

• concentratie buffers en waterstofionen

• duur fixatie

• concentratie fixatief

• snelheid en penetratie

• volumeveranderingen

• temperatuur

immersie fixatie

weefsel direct in fixatief plaatsen, werkt goed bij kleine weefsels, bij grotere worden niet alle regio’s bereikt → oplossing: fixatief door circulair systeem laten gaan waardoor alles wordt bereikt via vasculair netwerk

2. dehydrateren

weefsel in stijgende reeks van alcoholbaden (30-50-70-90-100°) + clearing met tolueen s

3. inbedden

gefixeerd materiaal omwikkelen en doordrengen met inbedmiddel (dringt in weefsel en maakt het hard waardoor het gesneden kan worden)

inbedmiddel

• harsen met hydrofiele structuur of hydrofiel inbedmiddel

• vriescoupe: als je snel resultaat nodig hebt, oplosbare bestanddelen aantonen, enymactiviteit aantonen, immunocyto/histochemie van gevoelige AGn

nadeel vriescoupes

ijskristallen
→ verhinderen: fixatie bij hoge druk en gebeurt snel

4. snijden

1. microtoom glazen mes (paraffine, bij LM)

2. microtoom met diamanten mes (bij EM)

auxochroom

vasthechting kleurstof aan weefsel

stappen H/E kleuring

1. deparaffineren

2. hydrateren: alcohol tot water

3. nucleaire kleuring: haematoxyline

4. differentiatie: zuur alcohol

5. bluing: ammoniumwater

6. counterkleuring: eosine

7. dehydratatie

8. clearing: xyleen

immunohistochemische kleurtechniek

molecule identificeren/lokaliseren obv antigene eigenschappen
→ AG/AL complex

polyclonaal AL

wordt door meerdere plasmacellen aangemaakt, kan met meerdere epitopen op AG binden

productie polyclonaal AL

1. AG ingespoten in konijn: immuunreactie

2. AG activeer B-cellen

3. plasma B-cellen produceren polyclonale AL

4. antiserum uit konijn waarin polyclonale ALn zitten

monoclonaal AL

uit 1 kloon plasmacellen, reageren met 1 epitoop op AG

productie monoclonaal AL

1. AG inspuiten in muis

2. B-lymfocyten uit milt halen (mix) en in tumorcellen brengen (knn alleen samen overleven dus zo selecteer je op de gefusioneerde)

3. hybirde cellen verder kweken in cultuurmilieu of in peritoneale ruimte van muizen → clones screenen en juiste eruit halen: diegene die reageren met AG, deze verder kloneren (uit 1 een kolonie laten groeien)

4. AL uit cultuur milieu (in supernatans) of uit vloeistof van peritoneale ruimte geoogst

HAT medium

hierin gebeurt celfusie en selectie van B-lymfocyten met tumorcellen

screening clones

ELISA
→ AG gecoat op wells + supernatans met AL → 2e AL waarop enzym zit toevoegen die op 1e AL bindt → substraat/chromofoor toevoegen → kleuring

aanmaak ALn verbeteren

peptide (AG) bindt aan carrier waardoor deze moeilijk worden afgebroken eenmaal ingespoten → zeker een AL tegen gemaakt

ook ingespoten tijdens immunisatie bij AG

Freund’s adjuvant
→ complete (CFA): water in olie emulsie + inactieve myobacteria (alleen eerste injectie)
→ incomplete (IFA): water in olie emulsie (resterende injecties)

→ depot functie en niet-specifieke immuunpotentiëring van macrofagen

AL zuiveren

• proteïne A: beads met daarop proteïne A → serum toevoegen → IgG bindt aan proteïne A, alle andere gaan er gewoon door → IgG eruit halen met zure oplossing

• antigen: beads gecoat met AG → serum toevoegen → AL die reageren met AG blijven achter → AL eruit halen met zure oplossing

voordelen monoclonaal vs. polyclonaal

• homogeniteit: je weet welk Ig

• specifiteit

• afwezigheid niet-specifieke ALn

nadelen monoclonaal vs polyclonaal

• fixatie vernietigd reactiviteit epitoop, dus hopen dat juist de jouwe niet wordt vernietigd

• epitoop op verschillende moln zorgt voor kruisreactiviteit

affiniteit AL

• intrinsiek: affiniteit AL om te binden aan AG

• functioneel: aviditeit, tijd nodig voor AL om evenwicht te bereiken met weefsel AG

merkersystemen immunohistochemische kleuring

• enzymen

• fluorochromen

• goudpartikels

immuno-enzymatische methode

gebruik van enzymen (HRP of AP)
→ geven op zichzelf geen kleur maar knn de omzetting van een kleurloos substraat en chromogeen (DAB of naftolfosfaatester) tot een gekleurd eindproduct katalyseren
→ DAB wordt geoxideerd mbv peroxidase
→ AP hydrolyseert naftolfostaatesters in aanwezigheid van metaalionen

multiple immunofluorescentie

ALn moeten in verschillende dieren gemaakt zijn om verschil te knn zien

flow cytometrie

bepaling van fysische of chemische karakteristieke van cellen of partikels die gesuspendeerd zijn in een vloeistofstroom en doorheen een meettoestel passeren
→ uitbreiding = FACS: cellen met bepaalde karakteristieke uit populatie halen
→ dubbelkleuring: partikels met verschillende afmetingen gebruiken
→ zilverversterking: met zilverionen goudbolletjes groter maken

mechanische zilverversterking

in aanwezigheid van een elektronendonor worden zilverionen gereduceerd tot metallisch zilver en wordt er zo’n laag op goudopp gezet

verminderen hydrofobe achtergrondkleuring

blocking serum toevoegen
→ vooraf aan weefselstuk en ook aan AL oplossing
→ bevat albumine EWn en normaal serum uit proefdier waaruit sec AL komt

normaal serum toevoegen

• niet-specifieke interacties tss sec AL en hydrofobe bindingsplaatsen in weefsel vermijden

• interacties tss endogeen AL en Fc receptoren in weefsel vermijden

voorbeeld van kleurprotocol (ABC methode)

1. voorbehandeling weefsel met 3% H2O2 om endogeen peroxidase te blokkeren

2. blocking serum toevoegen aan weefsel en aan AL oplossing

3. AL1 + wasstappen

4. AL2 (biotine)+ wasstappen

5. streptavidine + peroxidase

6. chromogeen substraat (DAB + H2O2 in buffer)

fixatie bij immunohistochemie

• vorm en structuur weefsel behouden en stabiliseren

• inhiberen autolyse met lysosomale enzymes

• bacteriële groei verhinderen

• reactieve groepen beschikbaar maken voor kleurstoffen

• membraan permeabel maken

• epitopen onveranderd laten en toegankelijk maken voor ALn

chemische fixatoren immunohistochemie

• niet additieve coagulerende fixatieven: denaturatie/coagulatie EWn waardoor EW 3D-structuur verliest en water eruit wordt geperst, weefsel krimpt maar epitopen blijven beter bewaard

• additieve fixatieven: reageren met AZn van EWn en cross-linken, EWn behouden 3D-structuur en vormen een complex, structuur behouden maar epitopen soms moeilijk bereikbaar
  → antigen retrievel: epitopen terug bereikbaar maken

methode AG retrieval

1. extensief wassen van weefselstuk

2. protease voorbehandeling: breken cross-linking tss fixatief en EWn waarin epitopen zitten

3. warmte gemedieerde AG retrieval met citraatbuffer of 1mM EDTA
   - verhitting: breken cross-links en vrijstellen CA2+ ionen
   - EDTA: cheleren of precipiteren CA2+ → permanent breken cross-links

Western blotting

lysaat met EWn op gel zetten (SDS-PAGE) → op membraan waar je EW kan visualiseren met AL

southern blotting

isoleren stuk DNA en knippen met restrictie-enzymen → op agarosegel en PCR doen → agarosegel naar membraan → hybridiseren met probe → bandje zichtbaar

northern blotting

isoleren stuk mRNA en knippen met restricti-enzymen → omzetten naar cDNA → op agarosegel en PCR → agarosegel naar membraan → hybridiseren met een probe → bandje zichtbaar

ISH techniek

DNA/RNA hybridiseren met probes gemerkt met radio-isotopen → detectie hybriden via autoradiografie (radioactieve bestandsdelen detecteren)

microscopische autoradiografie

weefsel met cellen die radioactief zijn onderdompelen in zilverbromidekorrels → radio-activiteit slaat korrels aan en dus na ontwikkeling blijven zilverbromidekorrels achter op de plaatsen waar er radio-activiteit was

RNA in situ hybridisatie

werken met sense en antisense riboprobes → sense is neg controle en antisense bindt met mRNA omdat mRNA altijd sense is

riboprobes maken

plasmide met een stuk cDNA (waarin gemerkt nucleotide zit) in begrensd door 2 promotors + 2 polymerasen die elk op een promotor binden en dus elk cDNA in een richting afschrijven → sense en antisens riboprobe

nick translatie

DNAse die in 1 van de strengen van DNA knipt → gaten worden herstelt door DNA polymerase met nucleotiden die gelabeld zijn
→ maken van probe

voorbeelden DNA probes

• centromeerprobes: herkennen repetitieve basepaarseq in centromeer, numerieke problemen aantonen

• single copy probes: herkennen basepaarseq die maar 1 keer in genoom voorkomt, gen aankleuren

• chromosoom paints

RNA probes

expressie waarnemen

stappen in ISH experiment

1. merken probe: nick translatie, random primed DNA labeling (primer die bindt waarna gelabelde nucleotiden worden ingebouwd), Taq DNA polymerase (PCR met gelabelde), eindlabeling, PRINS (oligonucleotide)

2. fixatie preparaat: bewaren morfologie

3. voorbehandeling preparaat: achtergrondkleuring verhinderen → RNAse als je DNA detecteert, endogene enzym inactivatie als merker een enzym is, permeabiliseren, proteolytische enzymen, detergenten

4. (denaturatie) en hybridisatie: hybridisatie bij hoge zoutconc want dan daalt elektrostatische repulsie, probe in overmaat tov doelwit

5. post-hybridisatie wasstappen: verminderen ruis van niet-specifieke hybridisatie en verwijderen niet gebonden probe

6. detectie hybriden: FISH (fluorochroom), enzymatisch (HRP en AP, LM op ISH), colloïdaal goud (EM op ISH)

DEPC

RNAse verwijderen, bel! als je RNA wilt detecteren

stringentie van hybridisatie

hoe specifiek en snel die gebeurt
→ laag = kruishybridisatie

confocaal vs. 2 foton microscopie

confocaal: foton komt toe en exciteert een elektron → bij terugval naar grondtoestand emitteert deze een foton van een langere golflengte → kegel van excitatie buiten focaal vlak

2 foton: 2 fotons met zelfde golflengte komen op zelfde moment toe en exciteren elektrone → bij terugval naar grondtoestand emitteert deze een foton met een kortere golflengte → illumineert maar 1 plek op focaal vlak

TIRF

total internal reflection fluorescence: excitatie van maar een dun laagje in preparaat
→ licht komt heel schuin toe op cel waardoor maar een dun laagje belicht wordt → enkel materiaal dat tegen glas zit wordt aangestraald

FRAP

fluorescence recovery after fotobleaching: dynamiek analyseren
→ met laser wordt signaal verwijderd op een punt → deze plaats wordt gevolg met de tijd en cellen naast die plaats zijn fluorescent gelabeld dus zo kan je beweging volgen als zijn gat proberen te dichten

FRET

Förster resonantie energie transfer: meten van afstanden, EWn die in complex zitten vinden
→ 2 EWn zitten apart en ene wordt bestraald met de juist golflengte en emitteert dan licht met een golflengte, signaal is dus alleen van dat EW te zien → 2 EWn maken contact en zitten dus dicht bij elkaar → energie gaat van ene fluorofoor naar andere en ander EW wordt aangeslagen en je ziet nu signaal hiervan

SIM

structured illumination microscopy
→ licht wordt door een gegraveerde plaat gestuurd waardoor een gestreept patroon ontstaat (nodig om punten dicht bij elkaar te onderscheiden) → sec later wordt licht in een iets ander patroon op preparaat gestuurd → … → computer zet beelden samen tot hoge resolutie omdat die onscherp licht kan verwijderen

STED

stimulated emission depletion
→ materiaal wordt 2 keer aangestraald → excitatie → breed signaal na 1e keer aanstralen van fluorochroom, maar breed signaal kan je verwijderen met 2e laser → scherp signaal blijft over

PALM

photoactivated localization microscopy
→ telkens een nieuw beeld maken waarin slechts enkele GFP moln worden belicht → elkeen emitteert foton in een gaussiaanse curve dus centrum kan berekend worden en dat allemaal samengebracht om een heel scherp beeld te vormen

licht veld microscopie

dikkere samples bekijken, snelle events vastleggen
→ laserstraal valt schuin in op materiaal maar materiaal wordt ook schuin bekeken

SBF-SEM

serial block fase -SEM
→ diamanten mes zit in microscoop, je snijdt coupe weg en telkens kijken wat overblijft → blijven herhalen en zo kan beeld gevormd worden van heel het weefsel

FIB-SEM

focused ion beam - SEM
→ met ionen een dun stuk weefsel wegnemen → kijken naar wat overblijft en herhalen → beeld volledige cel vormen

TFM

traction force microscopy
→ kracht meten die door cellen worden uitgeoefend
→ cellen zitten op immunofluorescente micronaalden en kracht kan berekend worden via kracht die op naalden wordt uitgeoefend

belichten preparaat

belangrijk om te doen met juiste lichtspectrum
→ sterk gedimd licht zal een rood en geel spectrum uitzenden
→ bij hogere lichtsterkte is licht vaak te intens → opgelost met filters: lichtintensiteit verminderen en rode component in spectrum reduceren

beschrijven licht

elektromagnetische golf, als die door een ander medium gaat verandert de lichtsnelheid
→ licht is polychromatisch en de verschillende golflengten worden op een verschillende manier gebroken

dispergerend vermogen

kleurschifting wit licht bij inval op materie
→ DV is klein voor lenzen
→ DV is groot voor prisma’s voor golflengtesplitsing

diffractie

ontstaat als licht door kleine opening gaat
→ opeenvolgende zones van heldere (constructieve interferentie: geen faseverschil) en donkere intensiteit (destructieve interferentie: faseverschil)
→ is grote beperkende factor voor resolutie van microscopische systeem

eigenschap elektronenbundel

dualiteit deeltjes-golf: je kan golfkarakteristiek toewijzen aan elektronenbundel
→ golflengte veranderen door spanning te veranderen, hoe lager de golflengte (meer potentiaal gebruikt) hoe meer detail

verandering richting lichtbundel en elektronenbundel

licht: holle lens (divergerend) en bolle lens (convergerend)

elektronen: onder invloed van een magnetisch veld

lenzenaberraties

sferische: stralen komen niet precies in 1 punt samen na afbuiging → diafragma die zorgt voor smallen doorgang licht

chromatische: brandpunt licht kortere golflengte valt niet samen met brandpunt licht langere golflengte = kleurschifting → samengestelde lenzen
→ achromaten: correctie voor rood en blauw licht
→ apochromaten: correctie voor alle golflengten

astigmatisme: door onvolmaaktheden van de lens → astigmator

beeldvlakkromming: voorwerp wordt afgebeeld op een kromme → lenzenstelsel gebruiken
→ aplanatische lenzen beelden voorwerp af in een plat vlak

plan apo objectieven

objectieven gecorrigeerd voor chromatische aberraties en beeldvlakkromming

vergroting bij LM

→ zorgen dat je ook meer detail ziet en niet enkel structuur groter

→ veroorzaakt door laterale vergroting objectief en hoekvergroting oculair (product van beide dus)

onderscheiden vermogen D + hoe verbeteren

→ dichtste afstand waarbij je 2 voorwerpen nog als gescheiden kan zien

→ verbeteren: werken met kortere golflengten, media gebruiken met grotere brekingsindex, immersie

resolutie

combinatie van onderscheiden vermogen en contrast

→ spatiale: mogelijkheid om 2 punten van elkaar te onderscheiden
→ contrast: mogelijkheid om kleine contrastverschillen waar te nemen

toepassing digitale beeldtechnologie bij microscopie

• statische beeldopname maken van deel preparaat bij vaste vergroting

• preparaat inscannen bij grote resolutie zodat het kan gebruikt worden bij virtuele microscopie

• digitale sturing: preparaat scannen maar enkel de regio’s die voldoen aan vooraf bepaalde criteria zullen gebruikt worden voor archivering en berekeningen

RGB-filters

rood-groen-blauw filters

CMY-filters

cyaan-magenta-geel filter

A/D-conversie

analoge impulsen omzetten in digitale helderheidswaarden

technieken bij klinische beeldvorming

• CT: computed tomography

• MRI: magnetic resonance imaging

• PET: positron emission tomography

• SPECT: single photon emission computed tomography

gap tussen microscopische en macroscopische beeldvorming

microscopische heeft een grote ruimtelijke resolutie maar een kleine massa en bij macroscopische is dit omgekeerd → tss de 2 zit nog een gap die we willen dicht om mens en molecule nog dichter bij elkaar te brengen → via preklinische medische beeldvorming

preklinsche medische beeldvorming

alle klinische beeldvormingstechnieken op een muis of een rat, de ruimtelijke resolutie is hier 10x groter dan bij klinische beeldvorming
→ is gewoon de klinische variant aangepast

optische beeldvorming levende dieren

bioluminescentie en fluorescente beeldvorming in levende dieren
→ ook een brug tss microscopische en macroscopische beeldvorming