HC 4: Fluorescence Microscopy

Energy levels in molecules: duration

Most → least amount of time

1. Phosphorescence

2. Fluorescence

3. Intersystem Crossing

4. Internal Conversion

5. Vibrational Relaxation

6. Absorption

Stokes Shift

"The differencfe between emission and absorption in wavelength

• never too high

• always some overlap

Photobleaching:

Irreversible loss of fluorescence due to photo-induced chemical reactions that destroy or modify the fluorophore

Reactive Oxygen Species (ROS)

FRET

niet-radiatieve transmissie van energie van de donor naar de acceptor (beide moleculen zijn fluorescent) (er wordt dus direct energie overgedragen van de één naar de ander. Hierbij komt geen foton vrij)

• hiervoor moeten ze heel dichtbij elkaar zijn (<10 nm) »energie via vibratie

• spectrum moet matchen (emmisie moet de absorptie matchen)

• After: alleen de acceptor emmits fluorescence

• traag, gevoelig voor fotobleking, en donor- en acceptormoleculen moeten in vergelijkbare mate tot expressie komen.

Types of fluorophores:

1.       Organic dyes

2.       Genetically encoded fluorescent proteins

3.       Quantum dots

1.Organic dyes:

• klein en synthetisch (meestal)

• fluorescentie komt van de ringstructuren in het molecuul!

• Sulfonering (SO3-) bevordert de solubilization en vermindert quenching na conjugatie

• Alexa = giftig (dus niet gebruiken op livebeelden!) en helder (structuren zijn zeer efficiënt)

2.Genetically encoded fluorescent proteins

• eiwitte gemaakt door de cel zelf

• hierdoor wordt met de tijd de levels weer normaal (tenzij je een plasmide gebruikt, aangezien deze deelt).

• F.e. GFP

• geeft kleur aan het eiwit op basis van de eigenschappen van het chromofoor

3.Quantum dots (QD)

• kleine bolletjes halfgeleidermateriaal (slechts tussen 100 en 100,000 atomen)

• absorberen lichtenergie, raken geëxciteerd en zenden fotonen uit wanneer ze terugkeren naar de grondtoestand

• de golflengte van het licht dat ze uitzenden afhankelijk is van hun grootte

• Kleinere QD's bezitten een grotere "minimale band gap"

»» Hebben dus meer energie nodig hebben voor excitatie

• De kern van QD’s kan degraderen en zware metaalionen, zoals Cd2+, vrijgeven, wat giftig is voor cellen (ook kunnen ze ROS produceren)

Bandpass (BP) Filters

Laat alleen een specifieke, smalle band van golflengten door en blokkeert golflengten die korter of langer zijn dan deze band

Toepassing: gebruikt om het uitgezonden (emissie) licht van fluorescerende kleurstoffen (zoals GFP) te isoleren.

»»Tegelijkertijd blokkeren ze zowel het excitatie-licht als achtergrondruis

Long-pass (LP) Filters

laat alleen golflengten door die langer zijn dan een bepaalde afsnijgolflengte —> blokkeert dus alle kortere golflengten

Toepassing: gebruikt om de langere golflengte van de fluorescentie-emissie te scheiden van het kortere golflengte excitatie-licht.

Dit type filter heeft echter als nadeel dat het autofluorescentie of achtergrondruis die op langere golflengten voorkomt, niet wegfiltert

Short-pass (SP) Filters

laat alleen golflengten door die korter zijn dan een bepaalde afsnijgolflengte (hoge energie)

Toepassing: gebruikt om lange golflengte ruis (zoals infrarood of warmte-inducerende golflengten) uit een lichtbron te filteren, zodat deze de gevoelige componenten niet bereiken

Dichroic beam splitter

scheiden van licht op basis van de golflengte

• Het reflecteert het kortere golflengte (excitatie) licht naar het monster

• Het laat het langere golflengte (emissie) licht, dat door het monster wordt uitgestraald, door naar de detector of camera

»Dit scheiden van absorptie en emissie wordt mogelijk gemaakt door de hoek waaronder de spiegel is geplaatst, vaak rond de 45 graden

Diascopic microscope

• monster van onderaf verlicht

• Conventionele microscopie (Brightfield)

• objectief alleen gebruikt voor detectie

Episcopic microscope

• Licht komt door het objectief

• Fluorescentiemicroscopie (Widefield, Confocal)

• objectief gebruikt voor zowel illuminatie als detectie