Cellebiologi

Hvad er de fire hovedtyper af cell signaling, og hvordan fungerer de?

• Contact-dependent: signalmolekyle sidder i membranen og kræver direkte cellekontakt

• Paracrine: lokale mediatorer diffunderer til nærliggende celler

• Endocrine: hormoner transporteres gennem blodet til fjerne celler

• Synaptic: neuroner frigiver neurotransmittere i synapser

Beskriv det generelle flow i cell signaling.

Et extracellulært signal binder en receptor → intracellulære signaling molecules aktiveres → effector proteins påvirkes → cellulært respons opstår.

Effector proteins kan ændre:

• metabolisme

• genekspression

• cytoskelet

• cellebevægelse/form

Hvad er forskellen mellem cell-surface receptors og intracellular receptors?

Cell-surface receptors binder typisk hydrofile/store signalmolekyler, som ikke kan krydse membranen.

Intracellular receptors binder små hydrofobe signalmolekyler, som kan diffundere gennem membranen og ofte regulerer genekspression direkte.

Hvorfor kan samme signalingmolekyle give forskellige effekter i forskellige celletyper?

Fordi forskellige celletyper udtrykker forskellige:

• receptorer

• intracellulære signaling proteins

• effector proteins

Eksempel: acetylcholine kan:

• sænke firing rate i hjertet

• stimulere sekretion i kirtler

• inducere kontraktion i skeletmuskel

Hvad er de tre hovedtyper af cell-surface receptors, og hvordan fungerer de?

1. Ion-channel-coupled receptors

Ligandbinding åbner/lukker ionkanaler → hurtige responser.

2. G-protein-coupled receptors (GPCRs)

Ligandbinding aktiverer G-proteiner, som regulerer enzymer eller ionkanaler.

3. Enzyme-coupled receptors

Ligandbinding aktiverer receptorens enzymaktivitet eller associerede enzymer, ofte via dimerisering.

Hvordan fungerer signaling via phosphorylation?

Protein kinases overfører fosfat fra ATP til målproteiner og ændrer deres aktivitet.

Protein phosphatases fjerner fosfatgrupper igen.

Balancen mellem kinase- og phosphataseaktivitet bestemmer signaling-outputtet.

Hvordan fungerer signaling via GTP-binding proteins?

GTP-bindende proteiner fungerer som molekylære switches:

• GDP-bundet = OFF

• GTP-bundet = ON

GEFs aktiverer ved at udskifte GDP med GTP.
GAPs inaktiverer ved at stimulere GTP-hydrolyse.

Hvordan sikrer cellen specificitet i signaling pathways?

Cellen bruger flere mekanismer:

• scaffold proteins samler signalingproteiner i komplekser

• modular interaction domains binder specifikke motiver/fosforyleringer

• lokal koncentration af signalingmolekyler i bestemte områder af cellen

Dette gør signaling hurtigere og mere præcis i det “støjende” cytoplasma.

Hvad betyder integration af multiple signaler?

Et cellulært respons kan kræve flere samtidige signaler (“coincidence detection”).

Eksempel:
Anchorage-dependent proliferation kræver både:

• growth factor signaling

• integrin signaling

Dette fungerer som en kontrolmekanisme, så celler ikke deler sig forkert.

Hvad er forskellen på hurtige og langsomme signaling-responser?

Hurtige responser

• sekunder til minutter

• ændrer aktivitet af eksisterende proteiner

• kræver ikke ny proteinsyntese

Langsomme responser

• minutter til timer

• ændrer genekspression

• kræver ny proteinsyntese

Hvordan kan forholdet mellem signal og respons variere mellem signaling pathways?

Pathways kan variere i:

• sensitivitet

• dynamisk range

• persistence

• signal processing

• integration

• coordination

Responskurver kan være:

• hyperbolske → gradvis respons

• sigmoidale → tærskel-lignende respons

• all-or-none → næsten ingen respons indtil tærskel nås

Hvilke mekanismer kan ændre formen på en signaling-responskurve?

• aktivering af allosteriske proteiner

• feedback-mekanismer

Disse kan gøre responset mere gradvist, skarpere eller switch-lignende.

Hvad er forskellen mellem positiv og negativ feedback i signaling pathways?

Positiv feedback

Et aktivt komponent stimulerer yderligere sin egen aktivering.

Kan give:

• hurtig forstærkning

• switch-lignende responser

• “memory”-effekter

Negativ feedback

Et aktivt komponent hæmmer pathwayet.

Kan give:

• stabilisering

• dæmpning af signal

• oscillationer hvis feedback er forsinket

Hvordan kan negativ feedback skabe oscillationer i signaling pathways?

Hvis negativ feedback er forsinket:

1. pathway aktiveres

2. inhibitor opbygges langsomt

3. pathway hæmmes

4. inhibitor forsvinder igen

5. pathway kan reaktiveres

Dette kan skabe gentagne oscillationer.

Hvordan kan celler justere deres sensitivitet til et signal?

Ved adaptation/desensitization.

Sensitiviteten afhænger af:

• antal receptorer

• receptorernes affinitet for ligand

Hvilke mekanismer kan reducere en celles sensitivitet til et signal?

• Receptor sequestration
  Receptorer fjernes midlertidigt fra plasmamembranen.

• Receptor down-regulation
  Receptorer nedbrydes i lysosomer.

• Receptor inactivation
  Receptoren inaktiveres direkte.

• Inactivation of signaling proteins
  Intracellulære signalingproteiner hæmmes.

• Production of inhibitory proteins
  Cellen producerer inhibitoriske proteiner.

Hvad karakteriserer G-protein-coupled receptors (GPCRs)?

GPCRs er celleoverfladereceptorer, som aktiverer trimere G-proteiner.

Mennesker har >800 GPCRs.

Ligander inkluderer:

• proteiner

• peptider

• aminosyrederivater

• fedtsyrer

• lys/fotoner

Beskriv aktiveringen af trimere G-proteiner via GPCRs.

1. Ligand binder GPCR

2. GPCR ændrer konformation

3. GDP på Gα udskiftes med GTP

4. Gα dissocierer fra βγ

5. Gα-GTP og βγ kan aktivere effektorproteiner

Hvilken vigtig enzymaktivitet har Gα-subunit?

Gα-subunit er en GTPase og kan hydrolysere GTP → GDP for at slukke signalet.

Hvordan klassificeres trimere G-proteiner?

De klassificeres efter deres Gα-subunit.

Fire hovedfamilier:

• Gs

• Gi

• Gq

• G12/13

Hvordan påvirker Gs og Gi adenylyl cyclase?

• Gs aktiverer adenylyl cyclase

• Gi inhiberer adenylyl cyclase

Beskriv den klassiske cAMP signaling pathway downstream for GPCRs.

1. Ligand aktiverer GPCR

2. Gs aktiveres

3. Gαs aktiverer adenylyl cyclase

4. ATP omdannes til cAMP

5. cAMP aktiverer PKA

6. PKA fosforylerer målproteiner og transcription factors (fx CREB)

Hvad er cAMP, og hvordan dannes det? Hvordan nedbrydes cAMP?

cAMP er en second messenger.

Det dannes fra ATP af enzymet adenylyl cyclase.

cAMP phosphodiesterase omdanner cAMP til 5’-AMP.

Hvad sker der når cAMP aktiverer PKA?

PKA fosforylerer intracellulære målproteiner og kan aktivere transcription factors som CREB, hvilket ændrer genekspression.

Beskriv signaling via Gq og phospholipase C-β.

1. GPCR aktiverer Gq

2. Gαq aktiverer phospholipase C-β (PLCβ)

3. PLCβ kløver PIP2 til:

   • DAG

   • IP3

4. IP3 åbner Ca²⁺-kanaler i ER

5. Cytosolisk Ca²⁺ stiger

6. DAG + Ca²⁺ aktiverer protein kinase C (PKC)

Hvad er funktionerne af IP3 og DAG?

• IP3 frigiver Ca²⁺ fra ER

• DAG aktiverer protein kinase C

Hvorfor bruges Ca²⁺ ofte som second messenger?

Ca²⁺ kan hurtigt ændre koncentration i cytosol og regulere mange proteiner og cellulære responser.

Hvordan kan feedback skabe Ca²⁺-waves og oscillationer?

Frigivet Ca²⁺ kan stimulere yderligere Ca²⁺-frigivelse fra ER via positiv feedback, hvilket skaber bølger og oscillationer.

Hvad er calmodulin?

Calmodulin er et Ca²⁺-bindende regulatorisk protein, som ændrer konformation når det binder Ca²⁺ og derefter aktiverer målproteiner.

Hvordan aktiveres CaM-kinase II, og hvorfor kaldes det et “molecular memory device”?

Ca²⁺/calmodulin aktiverer CaM-kinase II.

Kinase kan derefter autophosphorylere sig selv og forblive delvist aktiv selv efter Ca²⁺-niveauet falder.

Dette giver en form for cellulær “hukommelse”.

Hvilke typer cellulære responser kan GPCR pathways mediere via cAMP eller PLCβ?

GPCR signaling kan regulere mange forskellige responser afhængigt af væv og pathway.

cAMP-medierede responser:

• glykogennedbrydning

• øget hjertefrekvens

• hormonsekretion

• triglyceridnedbrydning

PLCβ-medierede responser:

• muskelkontraktion

• sekretion

• platelet aggregation

• Ca²⁺-signaling

Hvordan kan GPCRs signalere ud over cAMP og PLCβ pathways?

GPCRs kan:

• direkte aktivere ionkanaler

• indirekte regulere ionkanaler via cyclic nucleotides eller PKA

• aktivere small GTPases som Rho-familien og dermed regulere actin-cytoskelettet

Hvordan forstærkes signaler i GPCR signaling pathways?

GPCR pathways bruger enzymatiske kaskader og second messengers til signal amplification.

Et enkelt aktiveret receptorprotein kan aktivere mange G-proteiner, som aktiverer mange downstream molekyler og giver et stort cellulært respons.

Hvordan desensitiseres GPCRs?

Aktiverede GPCRs fosforyleres af GPCR kinases (GRKs).

Arrestin binder derefter til den fosforylerede receptor:

• forhindrer interaktion med G-proteiner

• fremmer receptor-endocytose

Dette reducerer signaling.

Hvad karakteriserer receptor tyrosine kinases (RTKs)?

RTKs er enzyme-coupled receptorer med en intracellulær tyrosine kinase domain.

Ligandbinding aktiverer receptoren og fører ofte til:

• cellevækst

• proliferation

• survival

• differentiering

Eksempler:

• EGF receptor

• insulin receptor

• VEGF receptor

• PDGF receptor

Hvordan aktiveres receptor tyrosine kinases (RTKs)?

1. Ligand binder receptorer

2. RTKs dimeriserer eller rearrangeres

3. Receptorerne trans-autophosphorylerer hinanden på tyrosiner

4. Phosphotyrosiner fungerer som docking sites for signaling proteins

Hvordan adskiller aktivering af insulinreceptoren sig fra EGF-receptoren?

Insulinreceptoren eksisterer allerede som en dimer før ligandbinding.

EGF-receptoren findes som monomer og dimeriserer først efter ligandbinding.

Hvad er funktionen af SH2- og PTB-domæner i RTK signaling?

SH2- og PTB-domæner binder phosphotyrosiner på aktiverede RTKs og rekrutterer intracellular signaling proteins til receptoren.

Hvordan aktiveres Ras downstream for RTKs?

1. Adapterproteinet Grb2 binder phosphotyrosiner på RTK via SH2-domain

2. Grb2 rekrutterer Sos via SH3-domain

3. Sos fungerer som Ras-GEF

4. Ras udskifter GDP med GTP og aktiveres

Beskriv Ras/MAPK signaling pathway downstream for RTKs.

Aktivt Ras-GTP aktiverer Raf (MAPKKK) → Raf aktiverer MEK (MAPKK) → MEK aktiverer ERK (MAPK).

ERK fosforylerer proteiner og transcription factors og ændrer:

• proteinaktivitet

• genekspression

Hvad er funktionen af protein tyrosine phosphatases?

De fjerner fosfatgrupper fra phosphotyrosiner og modvirker RTK signaling.

Hvilke funktioner har forskellige familier i Ras-superfamilien af monomere GTPaser?

• Ras: RTK signaling

• Rho: regulering af cytoskelet

• Rab: vesikeltrafik

• ARF: coat assembly på vesikler

• Ran: nuklear transport og mitose

Hvordan regulerer Rho-familien cytoskelettet?

Receptorer kan aktivere Rho-GEFs, som aktiverer Rho GTPases (fx RhoA).

Aktivt Rho regulerer actin-cytoskelettet og påvirker:

• cellebevægelse

• kontraktion

• growth cones

• celleform

Hvordan kan signal duration, intensity og localization påvirke cellulære responser downstream for RTKs?

Det samme signaling pathway kan give forskellige responser afhængigt af:

• hvor stærkt signalet er

• hvor længe det varer

• hvor i cellen signalet findes

Eksempel:

• transient ERK-aktivering → proliferation

• sustained ERK-aktivering → differentiering

Hvad er problemet ved at måle signaling i pooled cellepopulationer?

Average-signaler kan skjule store forskelle mellem individuelle celler.

En gradvis respons i en population kan faktisk skyldes:

• nogle celler er fuldt aktiverede

• andre er helt inaktive

Hvordan bruges FRET og BiFC til at studere signaling?

FRET og BiFC bruges til at måle:

• protein-protein interaktioner

• konformationsændringer

• signaling dynamics i levende celler

De fungerer via ændringer i fluorescens.

Beskriv PI3K-Akt signaling pathway downstream for RTKs.

1. RTK aktiverer PI3K

2. PI3K omdanner PIP2 → PIP3

3. PH-domain proteiner som Akt rekrutteres til membranen

4. Akt aktiveres af fosforylering

5. Akt fremmer survival og vækst ved at hæmme apoptose og stimulere growth pathways

PTEN modvirker pathwayet ved at fjerne fosfat fra PIP3.

Hvordan stimulerer Akt cellevækst via mTOR?

Akt inhiberer Tsc2, som normalt hæmmer Rheb.

Aktivt Rheb-GTP aktiverer mTORC1, som stimulerer:

• proteinsyntese

• ribosomproduktion

• cellevækst

Hvordan inaktiveres receptor tyrosine kinases (RTKs)?

RTKs kan inaktiveres via:

1. endocytose + dephosphorylering/recycling

2. endocytose efterfulgt af lysosomal nedbrydning

Beskriv JAK-STAT signaling pathway.

1. Cytokin binder receptor

2. Receptor-associerede JAKs aktiveres

3. JAKs fosforylerer receptoren

4. STATs binder phosphotyrosiner og fosforyleres

5. STATs dimeriserer

6. STAT-dimer går til nucleus og regulerer genekspression

Beskriv TGFβ/Smad signaling pathway.

1. GFβ binder receptor serine/threonine kinases

2. Receptorer fosforylerer Smad2/3

3. Smads binder Smad4

4. Smad-komplekset går til nucleus

5. Genekspression ændres

Inhibitory Smads (Smad6/7) hæmmer pathwayet via negativ feedback.

Hvordan fungerer Notch signaling?

Notch aktiveres ved kontakt mellem naboceller via Delta.

Ligandbinding fører til proteolytisk kløvning af Notch, så receptorens intracellulære del frigives og går til nucleus, hvor den regulerer target genes.

Notch signaling er vigtig for:

• celle fate determination

• lateral inhibition under udvikling.

Hvad er forskellen mellem canonical og non-canonical Wnt signaling?

Canonical Wnt pathway

Regulerer stabiliteten af β-catenin.

Uden Wnt nedbrydes β-catenin.
Med Wnt stabiliseres β-catenin og aktiverer target gene transcription.

Non-canonical Wnt pathway

Regulerer især:

• cellepolaritet

• actin-cytoskelet

• cellebevægelse

og involverer ofte Rho-familie GTPaser og Ca²⁺-signaling.

Hvordan kan Wnt signaling reguleres extracellulært?

Wnt signaling kan reguleres ved:

• soluble Wnt binders

• co-receptor binders

• fjernelse af lipid/fedtsyre fra Wnt

• regulering af receptor-nedbrydning

Disse mekanismer kan enten hæmme eller forstærke signaling.

Beskriv NFκB signaling pathway.

NFκB holdes normalt inaktivt i cytosol bundet til IκB.

Ved signalering:

1. IKK-komplekset fosforylerer IκB

2. IκB ubiquitinyleres og nedbrydes

3. NFκB frigives

4. NFκB translokerer til nucleus

5. NFκB aktiverer target genes

Negativ feedback kan skabe oscillationer i NFκB signaling.

Hvordan fungerer nuclear receptors?

Nuclear receptors er ligand-aktiverede transcription regulators for små hydrofobe molekyler som:

• steroidhormoner

• thyroidhormoner

• retinoider

• vitamin D

Ligandbinding aktiverer receptoren, som binder DNA og regulerer genekspression.

Hvordan overlapper signaling pathways fra GPCRs og RTKs?

GPCRs og RTKs kan aktivere mange af de samme downstream pathways, fx:

• MAPK pathway

• PI3K/Akt pathway

• PLC/Ca²⁺ pathway

Signal integration mellem pathways er vigtig for at bestemme det endelige cellulære respons.

Hvad er cytoskelettets overordnede funktioner, og hvilke tre hovedtyper af filamenter består det af?

Cytoskelettet fungerer som cellens “skelet og muskler” og bruges til at:

• opretholde struktur og mekanisk styrke

• ændre celleform

• celledeling

• bevægelse af celler og organeller

De tre hovedtyper af filamenter er:

• aktinfilamenter (mikrofilamenter)

• mikrotubuli

• intermediære filamenter

Hvad karakteriserer aktinfilamenter?

Aktinfilamenter er fleksible, helikale polymerer af aktin (~8 nm). De findes især i cortex lige under plasmamembranen.

Figuren viser at aktin:

• kan danne bundter og netværk

• findes i mikrovilli

• danner stressfibre ved fokale adhæsioner

• indgår i filopodia og lamellipodia

Aktin er derfor særligt vigtigt for cellebevægelse og dynamiske formændringer.

Hvad karakteriserer mikrotubuli?

Mikrotubuli er lange, hule tubulinrør (~25 nm) som er mere stive end aktinfilamenter.

Figuren viser at de:

• organiseres fra et centrosom/MTOC

• findes i cilier

• hjælper med intracellulær transport

• danner den bipolære mitotiske spindel ved celledeling

Hvad karakteriserer intermediære filamenter?

Intermediære filamenter er reb-lignende fibre (~10 nm), som giver mekanisk styrke.

Figuren viser at de:

• spænder gennem cytoplasmaet

• forbinder celle-celle junctions

• styrker epithelvæv

• danner nuclear lamina under kernemembranen

De er mindre dynamiske end aktin og mikrotubuli.

Hvordan er cytoskelettet organiseret forskelligt i forskellige celletyper?

Cytoskelettet tilpasses cellens funktion:

• Delende celler: mikrotubuli organiseres i den mitotiske spindel

• Polariserede epitelceller: aktin findes apikalt ved mikrovilli, intermediære filamenter forbinder desmosomer, og mikrotubuli hjælper med polaritet

• Neuroner: mikrotubuli organiseres i axonet, mens aktin findes i growth cones

Figuren understreger, at cytoskelettet bestemmer cellulær organisering og polaritet.

Hvordan bidrager aktindynamik til udvikling og myelinisering af oligodendrocytter?

Under modning ændrer oligodendrocytter form dramatisk for at kunne danne myelin omkring axoner.

Figurerne viser:

• process extension og branching

• overgang fra simple til komplekse lamellare strukturer

• reorganisering af aktin under differentiering

Aktinpolymerisering er nødvendig i de tidlige stadier for udvækst og branching.

Hvad viser jasplakinolide-eksperimentet om aktin?

Jasplakinolide stabiliserer aktinfilamenter og hæmmer normal aktindynamik.

Eksperimentet viser derfor, at dynamisk reorganisering af aktin er nødvendig for korrekt modning af oligodendrocytter og normale morfologiske ændringer. (man kan ikke se billedet på slides, så det her er fra nettet)

Hvorfor giver multiple protofilamenter både stabilitet og dynamik?

En enkelt protofilament er termisk ustabil, fordi et brud kun kræver at én binding brydes.

Når flere protofilamenter samles:

• kræver brud mange bindinger → høj stabilitet

• men enderne kan stadig vokse og krympe relativt let → dynamik

Figuren forklarer derfor, hvordan cytoskelet-filamenter både kan være stabile og samtidig hurtigt reorganiseres.

Hvordan er aktinfilamenter opbygget, og hvad betyder deres polaritet?

Aktinfilamenter dannes ved head-to-tail samling af aktinmonomerer, hvilket giver filamentet polaritet med:

• en plus-end (+)

• en minus-end (−)

Plus-enden vokser hurtigere end minus-enden. Filamentet består af ATP-bindende aktin, hvor ATP senere hydrolyseres til ADP efter inkorporering i filamentet.

Hos vertebrater findes α-actin især i muskelceller, mens β- og γ-actin findes i andre celletyper.

Hvilke faser indgår i aktinpolymerisering?

Aktinpolymerisering foregår i tre faser:

1. Nukleation (lag phase)
   Små oligomerer dannes langsomt. Dette er den rate-limiterende fase.

2. Elongation (growth phase)
   Monomerer tilføjes hurtigt til filamentenderne, især plus-enden.

3. Steady state (equilibrium phase)
   Tilføjelse og tab af subunits balancerer hinanden.

Figuren viser også, at tilsætning af “preformed filament seeds” fjerner lag-fasen ved at omgå nukleation.

Hvad er treadmilling i aktinfilamenter?

Treadmilling sker når:

• subunits tilføjes ved plus-enden

• subunits fjernes ved minus-enden

samtidig med at filamentets samlede længde forbliver omtrent konstant.

Dette skyldes:

• ATP-actin binder stærkere og favoriserer vækst

• ATP hydrolyseres efter inkorporering

• ADP-actin er mindre stabilt og dissocierer lettere

Treadmilling opstår når monomerkoncentrationen ligger mellem den kritiske koncentration for plus- og minus-end:

Cc(T) < C < Cc (D)

Hvordan regulerer thymosin og profilin aktinpolymerisering?

Begge proteiner binder aktinmonomerer, men har modsatte effekter:

• Thymosin binder aktin og forhindrer polymerisering

• Profilin binder aktin og fremmer binding til plus-enden

Konkurrencen mellem profilin og thymosin regulerer derfor hvor meget frit aktin der er tilgængeligt for filamentvækst.

Hvordan accelererer Arp2/3 og formin aktinpolymerisering?

Begge fungerer som nukleeringsfaktorer:

• Arp2/3-komplekset danner forgrenede aktin-netværk

• Formin danner lange, uforgrenede filamenter

Arp2/3 er vigtigt i lamellipodia, mens formin ofte bruges til stressfibre og filopodia.

Hvordan påvirker capping- og severing-proteiner aktindynamik?

Capping-proteiner binder filamentender og regulerer vækst:

• CapZ binder plus-enden

• Tropomodulin binder minus-enden

• Tropomyosin stabiliserer filamenter

Severing-proteiner fremmer depolymerisering:

• Gelsolin kløver filamenter (aktiveres af højt Ca²⁺)

• Cofilin binder især ADP-actin og destabiliserer filamenter

Balancen mellem stabiliserende og destabiliserende proteiner bestemmer filamentdynamikken.

Hvordan bestemmer filament-bindende proteiner typen af aktin-netværk?

Forskellige crosslinking-proteiner giver forskellige netværk:

• Fimbrin → tætte parallelle bundter

• α-actinin → kontraktile bundter

• Filamin → tredimensionelle netværk

Figuren viser at netværkets struktur bestemmer dets funktion.

Hvordan er aktin organiseret i en migrerende fibroblast?

Forskellige områder af cellen indeholder forskellige aktin-strukturer:

• Stress fibers → kontraktile bundter

• Cell cortex → gel-lignende netværk

• Lamellipodium → dendritisk/netværksstruktur

• Filopodium → tætte parallelle bundter

Denne organisering gør det muligt for cellen både at bevæge sig og generere mekanisk kraft.

Hvilke hovedmekanismer bruger aktin-bindende proteiner til at regulere filamentdynamik?

De vigtigste mekanismer er:

1. Kontrol af monomer-tilgængelighed

2. Acceleration af polymerisering via nukleeringsfaktorer

3. Regulering af filamentender via capping-proteiner

4. Depolymerisering via severing-proteiner

5. Organisering af filamentnetværk via crosslinking-proteiner

Figuren samler de vigtigste aktin-regulatorer i ét overblik.

Hvordan samarbejder aktin-bindende proteiner om aktin turnover?

Figuren viser et cyklisk system:

1. ADF/cofilin depolymeriserer ADP-actin filamenter

2. Profilin binder ADP-actin monomerer

3. Profilin fremmer nucleotide exchange til ATP-actin

4. Thymosin β4 kan sequestrere ATP-actin

5. Profilin frigør monomerer fra thymosin

6. Profilin leverer ATP-actin til filamentets plus-end

Sammen gør disse proteiner hurtig og kontrolleret reorganisering af aktin-cytoskelettet mulig.

Hvilke værktøjer bruges til at studere aktindynamik?

Forskellige stoffer kan manipulere aktinfilamenter:

• Phalloidin → binder og stabiliserer filamenter

• Cytochalasin → capper plus-enden

• Swinholide → kløver filamenter

• Latrunculin → binder aktinmonomerer og forhindrer polymerisering

Visualisering af aktin kan ske med:

• fluorescensmærket phalloidin

• GFP-fusionsproteiner

• LifeAct eller F-actin probes i levende celler

Hvordan genererer myosin kraft på aktinfilamenter?

Myosin er ATP-drevne motorproteiner der bevæger sig langs aktinfilamenter.

Kraft genereres gennem en cyklus:

1. ATP binder myosin → myosin slipper aktin

2. ATP hydrolyseres → myosinhovedet “cockes”

3. Myosin binder aktin igen

4. Frigivelse af Pi udløser power stroke

5. ADP frigives → ny ATP kan binde

Denne cyklus omdanner kemisk energi fra ATP til mekanisk bevægelse.

Hvordan er aktin og myosin organiseret i muskelceller?

Muskelfibre består af gentagne sarcomerer:

• Tynde filamenter = aktin

• Tykke filamenter = myosin

Aktin er forankret i Z-discs, mens myosin ligger centralt omkring M-line.

Når myosin glider langs aktin, forkortes sarcomeren og musklen kontraherer.

Figuren viser også:

• mørke bånd = områder med myosin

• lyse bånd = områder med kun aktin

Hvordan initierer Ca²⁺ muskelkontraktion?

I skeletmuskel:

• et aktionspotentiale åbner Ca²⁺-kanaler i SR

• Ca²⁺ frigives til cytosolen

• Ca²⁺ binder troponin

• tropomyosin flyttes væk fra aktin

• myosin kan nu binde aktin → kontraktion

I glat muskulatur:

• Ca²⁺ binder calmodulin

• Ca²⁺/calmodulin aktiverer MLCK

• MLCK fosforylerer myosin light chain

• myosin aktiveres og kontraktion starter

Hvilke funktioner har actin-myosin interaktioner i ikke-muskelceller?

I ikke-muskelceller bruges actin-myosin til:

• cellemigration

• kontraktion under cytokinese

• intracellulær transport

Myosinaktivitet reguleres ofte ved fosforylering af myosin light chains.

Hvordan er mikrotubuli opbygget?

Mikrotubuli er hule rør opbygget af protofilamenter.

Hvert protofilament består af α/β-tubulin heterodimere arrangeret head-to-tail, hvilket giver polaritet:

• plus-end

• minus-end

13 protofilamenter danner tilsammen et mikrotubulus-rør.

Tubulin binder GTP, som er vigtigt for polymerisering og stabilitet.

Hvad er dynamisk instabilitet i mikrotubuli?

Mikrotubuli skifter mellem:

• vækst

• hurtig depolymerisering

Dette kaldes dynamisk instabilitet.

En GTP-cap stabiliserer den voksende ende. Hvis GTP-cappen mistes:

• GDP-tubulin destabiliserer filamentet

• protofilamenter bøjer udad

• hurtig depolymerisering (“catastrophe”) sker

Genetablering af GTP-cap kaldes “rescue”.

Hvordan nukleeres mikrotubuli?

γ-tubulin ring complexes (γ-TuRC) fungerer som nukleeringsskabeloner for mikrotubuli.

De findes ofte i centrosomet, hvorfra mikrotubuli vokser ud:

• minus-end forankres ved centrosomet

• plus-end vokser ud mod cytoplasmaet

Figuren viser også centrosomet som et microtubule-organizing center (MTOC).

Hvordan er mikrotubuli organiseret forskelligt i forskellige celletyper?

Mikrotubuli-orientering afhænger af celletypen:

• Fibroblaster: radial organisation fra centrosomet

• Epithelceller: organiseret langs apikal-basal aksen

• Axoner: plus-ender peger distalt

• Dendritter: blandet orientering

• Muskelceller: parallelle arrays langs cellens længdeakse

Denne organisering hjælper med:

• intracellulær transport

• polaritet

• celledeling

• formopretholdelse.

Hvordan regulerer mikrotubuli-bindende proteiner mikrotubuli-dynamik?

Plus-end-bindende proteiner kan enten stabilisere eller destabiliserer mikrotubuli.

Eksempler fra figuren:

• Kinesin-13 → øger catastrophe og depolymerisering

• XMAP215 → øger polymerisering og vækst ved plus-enden

Andre proteiner:

• MAP2 og tau binder langs siden af mikrotubuli og stabiliserer dem

• Stathmin binder tubulin-dimere og forhindrer assembly

Mikrotubuli-dynamik reguleres altså både ved:

• ændring af væksthastighed

• stabilisering

• severing

• sequestrering af tubulin.

Hvilke typer mikrotubuli-associerede proteiner findes der?

Forskellige MAPs har forskellige funktioner:

• γ-TuRC → nukleerer mikrotubuli

• +TIPs → binder voksende plus-ender

• XMAP215 → fremmer assembly

• Kinesin-13 → inducerer catastrophe

• Katanin → severer mikrotubuli

• Tau og MAP2 → stabiliserer og bundler mikrotubuli

• Plectin → linker mikrotubuli til intermediate filaments

• Stathmin → binder frie tubulin-dimere og hæmmer polymerisering

Figuren viser også, at severing kan skabe nye mikrotubuli-ender og dermed ændre netværksorganisationen hurtigt.

Hvordan påvirker post-translationelle modifikationer mikrotubuli?

Tubulin kan modificeres kemisk efter translation, hvilket påvirker mikrotubuli-egenskaber.

Eksempler:

• acetylering

• glutamylering

• glycylation

• tyrosinering

• fosforylering

Disse modifikationer påvirker:

• stabilitet

• depolymerisering

• hvilke motorproteiner der binder

• motorproteiners hastighed

Hvordan kan man eksperimentelt undersøge mikrotubuli-dynamik?

Kemisk manipulation

Forskellige stoffer kan stabilisere eller nedbryde mikrotubuli:

Stoff	Effekt	Mekanisme
Taxol (paclitaxel)	Stabiliserer mikrotubuli	Binder langs filamentet
Nocodazole	Depolymeriserer	Binder tubulin-subunits
Colchicine	Depolymeriserer	Capper filament-ender

Taxol bruges derfor ofte til at forhindre dynamik, mens nocodazole og colchicine bruges til at nedbryde mikrotubuli-netværket.

Visualisering

Mikrotubuli kan visualiseres med:

• GFP-tubulin

• GFP-EB1 (+TIP protein)

EB1-markerede “comets” viser voksende plus-ender og bruges til at måle væksthastighed og dynamik.

Hvordan fungerer motorproteiner på mikrotubuli?

Der findes to hovedtyper:

Motorprotein	Bevægelsesretning
Dynein	Mod minus-end
Kinesin	Mod plus-end

Motorproteiner bruger ATP-hydrolyse til at “gå” langs mikrotubuli.

Kinesin

Kinesin bevæger sig typisk mod plus-enden via en “hand-over-hand” mekanisme:

1. ATP binder til leading head

2. Hals-regionen ændrer konformation

3. Det bageste hoved svinger frem

4. ATP hydrolyseres og cyklussen fortsætter

Funktioner

Kinesiner bruges til:

• transport af vesikler og organeller

• organisering af mikrotubuli

• regulering af mikrotubuli-dynamik

Dynein samarbejder ofte med dynactin-komplekset for effektiv cargo-transport.

Hvordan bruges mikrotubuli og motorproteiner til intracellulær transport?

I neuroner

Axoner indeholder lange mikrotubuli-spor:

• kinesin transporterer cargo mod synapsen (+ ende)

• dynein transporterer cargo tilbage mod cellekroppen (− ende)

Dette er vigtigt, fordi neuroner er meget lange celler og kræver effektiv transport.

I melanocytter

Melanosomer kan enten:

• være dispergerede i hele cellen

• samles centralt

cAMP regulerer dette:

• ↑ cAMP → dispergering

• ↓ cAMP → aggregering

Transporten sker via motorproteiner på mikrotubuli.

Hvad er intermediate filaments?

Intermediate filaments er stærke cytoskelet-filamenter, der giver mekanisk styrke.

Der findes ca. 70 IF-gener opdelt i 5 klasser:

Type	Protein	Lokalisation
I	Lamins	Nuklear lamina
II	Vimentin	Mesenkymale celler
III	Desmin, GFAP m.fl.	Muskel og glia
IV	Keratiner	Epitel
V	Neurofilamenter	Neuroner

De er mere stabile end aktin og mikrotubuli.

Hvordan er intermediate filaments opbygget?

Assembly foregår trinvis:

1. Monomer med α-helikal region

2. Coiled-coil dimer

3. To dimere danner antiparallelt tetramer

4. Tetramere pakkes lateralt

5. Lange filamenter dannes

Vigtige egenskaber:

• ingen polaritet

• binder ikke ATP eller GTP

• meget fleksible og stærke

Manglende polaritet betyder også, at motorproteiner ikke går på IFs.

Hvad er intermediate filaments funktion?

Intermediate filaments giver mekanisk styrke til væv.

Eksempel:

• keratin-filamenter kobles til desmosomer og hemidesmosomer i epithel

Dette hjælper celler med at modstå stræk og mekanisk stress.

Epidermolysis bullosa

Mutationer i keratiner eller linkerproteiner giver skrøbelig hud, hvor epidermis let løsner sig og danner blærer.

Hvordan forbindes cytoskelettet med kernen?

Plectin

Plectin forbinder:

• intermediate filaments

• aktin

• mikrotubuli

• adhæsionskomplekser

SUN-KASH komplekset

SUN-KASH proteiner spænder over kernemembranen og forbinder:

• cytoskelettet i cytoplasma

• nuklear lamina og kromosomer i kernen

Dette skaber mekanisk kobling mellem celleoverflade og nucleus.

Hvorfor er koblingen mellem cytoskelet og nucleus vigtig?

Koblingen bruges til:

1. Nuclear positioning

Kernen placeres korrekt i:

• migrerende celler

• muskelceller

• epithel

• neuroner

2. Mechanosensing

Mekaniske signaler fra ECM kan overføres til nucleus og ændre genekspression.

Det gør, at celler kan reagere på:

• stræk

• stivhed

• mekanisk belastning

Hvad er septiner?

Septiner er GTP-bindende filamentproteiner.

De:

• danner hetero-hexamere eller octamere

• organiserer sig til nonpolære filamenter

Funktioner:

• compartmentalization af membraner

• interaktion med aktin og mikrotubuli

• vigtig for asymmetri i celler

Septiner er især vigtige ved:

• cytokinese

• budding i gær

• polariserede celler

Hvordan etableres cellepolaritet?

C. elegans embryo

Sperm-entry bryder symmetrien → PAR-proteiner reorganiseres:

• anterior PAR-proteiner samles i én ende

• posterior PAR-proteiner i den anden

Dette etablerer anterior-posterior polaritet.

Epitelceller

Epitelceller opdeles i:

• apikal domæne

• basolateral domæne

Proteinkomplekser:

• PAR

• Crumbs

• Scribble

hjælper med at etablere og vedligeholde denne polaritet.

Polaritet er vigtig for:

• transportretning

• vævsorganisation

• cellefunktion.

Hvordan regulerer Rho-familien aktin-cytoskelettet?

Rho-familiens små GTPaser fungerer som molekylære switches:

• GDP-bundet = inaktiv

• GTP-bundet = aktiv

Reguleres af:

• GEFs → aktiverer (GDP → GTP)

• GAPs → inaktiverer

• Rho-GDI → holder Rho i cytosol og hæmmer aktivering

Tre centrale medlemmer

Protein	Primær effekt
Cdc42	Filopodia
Rac	Lamellipodia / branched actin
RhoA	Stress fibres og kontraktion

Cdc42

Aktiverer:

• WASP/WAVE

• Arp2/3

→ danner forgrenede aktin-netværk og protrusioner.

Rac

Stimulerer protrusion og cellebevægelse via Arp2/3-medieret aktinpolymerisering.

RhoA

Aktiverer ROCK:

• øger myosin aktivitet

• hæmmer myosin phosphatase

• stabiliserer stress fibres og focal adhesions

→ mere kontraktilitet.

Hvordan bevæger celler sig?

Cellemigration foregår i tre trin:

Trin	Cytoskelet-funktion
1. Protrusion	Aktinpolymerisering skubber membranen frem
2. Attachment	Integriner danner focal adhesions
3. Traction	Actin-myosin kontraktion trækker cellen frem

Hvordan styrer Rac og Rho rettet migration?

Ved kemotaksi i neutrofiler:

Front af cellen

Rac dominerer:

• aktinpolymerisering

• protrusion

• lamellipodia

Bagende af cellen

Rho dominerer:

• actin-myosin kontraktion

• retraktion af bagenden

Signalgradienter fra chemoattractants skaber asymmetrisk aktivering af Rac og Rho.

Det giver:

• en protruderende front

• en kontraherende bagende

→ retningsbestemt bevægelse.