LAB MICRO PARCIAL 2

interacciones antigeno-anticuerpo: primaria

* Consiste en la unión del antígeno con los focos disponibles de una cierta molécula de anticuerpo.
* ○  Se pueden estudiar las reacciones primarias antígeno-anticuerpo "in vitro" por varias técnicas:
* Precipitación con sulfato de amonio
* Observación visual utilizando sustancias fluorescentes

interaccion antigeno-anticuerpo: secundarias

* Forman la base de varias pruebas de laboratorio utilizadas para identificar y reconocer antígenos que intervienen en los fenómenos patológicos.
* ○  Incluyen la precipitación, aglutinación, reacciones debidas al complemento, neutralización y efectos psicotrópicos y floculación.

interacciones antigeno-anticuerpo

* Tienen lugar "in vivo", y a veces pueden ser útiles para el paciente; pero en

otras ocasiones producen enfermedad debida a lesión inmunológica.
* ○  Pertenecen a este tipo de interacciones las reacciones de hipersensibilidad

tardía, anticuerpos citotóxicos, complejo antígeno-anticuerpo e hipersensibilidad inmediata.

Interacciones antígeno anticuerpo secundarias


0. Precipitación

* Se presenta entre un antígeno soluble y el anticuerpo específico.
* ●  Prueba del anillo:
* ○  Se coloca una pequeña cantidad de anticuerpos o antisuero en los tubos capilares
* ○  Se coloca una pequeña cantidad del antígeno sobre los anticuerpos
* ○  Si los anticuerpos son específicos para el antígeno, una línea fina de precipitación se observa en la interfase después de algunos minutos.
* ●  Inmunoelectroforesis

0. Floculación

* Reacción entre un antígeno coloidal y el antisuero específico.
* ●  Antígeno coloidal: Cardiolipina (lípido liberado cuando la célula se rompe)

●  Pruebas inespecíficas rápidas no treponémicas: VDRL y RPR para el diagnóstico de la sífilis NO ES CONFIRMATORIA

\
rpr floculacion

vdrl = aglutinacion

\
* PRUEBAS TREPONEMICAS= confirmatorias (fta-abs)

0. Aglutinación

* Reacción que se presenta entre un antígeno particulado y el anticuerpo específico
* ●  Antígeno particulado: Glóbulos rojos


* Pruebas de aglutinación pueden realizarse en tubos de ensayo y placas especiales de aglutinación.
* ●  Valor diagnóstico → es necesario tener títulos de anticuerpos en la fase crónica de la enfermedad

* Reacciones de aglutinación:

*  Reacciones febriles
* ○  Pruebas de hemoaglutinación directa e indirecta
* ○  Inhibición de la hemaglutinación

0. Evaluación de la Inmunidad innata

Se evalúa la fagocitosis, la inflamación, las células asesinas naturales y el sistema

de complemento. \n ○ Evaluación de la quimiotaxis

* Se mide la locomoción direccional de los neutrófilos hacia los diversos estímulos quimiotácticos
* Pruebas de laboratorio: Cámara de Boyden

0. Proteína C Reactiva

* Se eleva en infecciones, proceso inflamatorio, etc
* ●  Se produce en los hepatocitos y es inducidas por las interleucinas
* ●  Actúa en presencia de calcio con el mucopolisacárido C del estreptococo

Factor reumatoide

* La artritis reumatoide (enfermedad autoinmune) es un síndrome crónico de etiología desconocida caracterizado por una inflamación inespecífica y generalmente simétrica de las articulaciones, que a veces evoluciona hacia la destrucción de las estructuras articulares y periarticulares
* ●  En las articulaciones dañadas se observa un engrosamiento de la membrana sinovial con una formación de pliegues y proliferación de linfocitos, estas células que forman folículos linfoides son los responsables de la síntesis de factores reumatoides (FR) y otras inmunoglobulinas
* ●  Los FR son generalmente de tipo IgM anti IgG es decir reaccionan con las fracciones Fc de la IgG


* \
* Los FR de tipo IgM están presentes en el 85 al 90% de los adultos con artritis reumatoide, aunque no es específico de la enfermedad, ya que se ha encontrado en el 3-5% de personas sanas.

Reacciones febriles

* Los antígenos febriles se usan para detectar anticuerpos en el suero de pacientes contra: Salmonella, Brucella y Rickettsia (Rickettsia presenta reacción cruzada con Proteus OX19)
* ●  Estas infecciones bacterianas inducen fiebre en los pacientes
* ●  Aglutininas. Son anticuerpos que aglutinan
* ●  Utilidad diagnóstica de las reacciones febriles

Reaccion de Widal

Reaccion de aglutinacion directa en lTienen ácidos micólicos: Mycobacterium - ácido micólico \n Nocardia \n Nocardia brasiliensis \n Corynebacterium difteriae - Bacilos pequeños, forma de letras chinas, tienen ácidos micólicos 30 carbonos, se colorean con gramma cual las bacterias son los antígenos particulados que reaccionan con los anticuerpos presentes

en el suero de los pacientes \n ○ Útil en el diagnóstico de fiebre tifoidea (producida por la salmonella)

Reaccion de Weil-Felix

Diagnóstico de Rickettsia typhi \n Antígeno es una cepa de Proteus OX19 \n Reacción indirecta. Reacción cruzada \n Depende de la actividad de anticuerpos con cepas proteus sp.

Reaccion de Huddleson

Diagnóstico de Brucelosis Antígeno Brucella abortus Reacción cruzada

Prueba Rápida para el diagnóstico de Reaginas (RPR) para =

sifilis , prueba de floculación, detección y titulación de reaginas

* Se puede hacer con el suero o plasma del paciente.
* ●  Es cualitativa y cuantitativa

Treponema Pallidium es el agente etiológico de sífilis

Serología

* Las técnicas de diagnóstico serológico son aquellas que diagnostican una

enfermedad infecciosa utilizando la especificidad de las reacciones

antígeno-anticuerpo.

*  Diferentes tipos de reacciones serológicas:

* Aglutinación
* ○  Floculación
* ○  Precipitación
* ○  ELISA (Enzimoinmunoensayo)
* ○  Inmunofluorescencia
* ○  Inmunoelectroforesis

* Título de anticuerpos

* es la cantidad de anticuerpos presentes en el suero del paciente, es la más alta dilución del suero que da reacción positiva, o lo que es lo mismo , el inverso de la mayor dilución o menor concentración del suero del enfermo que presenta reacción positiva

* Para que una reacción antígeno-anticuerpo tenga valor diagnóstico,

* el título de anticuerpos presentes debe ser cuatro veces más de lo normal.

* La muestra usada para determinar anticuerpos

* es generalmente sangre ( o LCR o pleural) ésta se deja coagular y se separa el suero que es el utilizado para las pruebas→ Se toma la muestra entonces del suero.

*  Tomar dos muestras de sangre:

* durante fase aguda y fase convaleciente.

Seroconversión

* A cada una se le determina título de anticuerpos si se presenta un incremento entre ambas muestras

* IgG
* IgM

* IgG revela recuerdo inmunológico.
* ●  IgM producida durante la infección demuestra una infección activa.

Ensayo de Inmunoabsorción ligado a Enzima (ELISA):

Se utiliza una enzima conjugada con un anticuerpo que reacciona con un sustrato incoloro para generar un producto con una reacción de color. A este sustrato se le conoce como sustrato cromógeno.

2 tipos de pruebas reacciones antígeno anticuerpo:

* Específicas: Pruebas confirmatorias de que el paciente tiene sífilis, presencia de la bacteria en el paciente, utilizando anticuerpos fluorescentes; prueba específica- anticuerpo fluorescente.
* ●  Inespecífica: RPR Prueba rápida de reaginas. (reaginas son sintetizadas por diversos microorganismos, por eso no es específica)

prueba sifilis

antigeno y anticuerpo a detectar

* El Antígeno: Cardiolipina
* ●  El Anticuerpo a detectar: Reaginas

0. La prueba Antilatex proteína C reactiva

*  Es una prueba de aglutinación
* ●  Es un anticuerpo particulado de látex → para aglutinar (que no se diluye)
* ●  Antilatex PCR→ Anticuerpo en contra de la PCR

prueba proteina c reactiva = pcr

* Antígeno: Proteína C
* -  Anticuerpo: Anti Látex proteína C

REACCIONES FEBRILES \n

Los antígenos febriles se usan para detectar anticuerpos en el suero del paciente contra Salmonella, Brucella Rickettsia

(reacción cruzada con ProteusOX-19).

factor reumatoide

antigeno y anticuerpo

* Muestra: Obtener sangre, centrifugar y separar el suero.
* ●  Antígeno usado: IgM

cultivo faringeo

\: Obtener un exudado faríngeo, aislar colonias bacterianas en medios enriquecidos y selectivos, conocer la flora normal de faringe e identificar microorganismos patógenos en la muestra faríngea e identificar Streptococcus pyogenes por la técnica de ELISA manual Strep A.

● Streptococcus pyogenes, principal patógeno causante del 80% de las faringitis bacterianas.

0. Indicaciones antes de ir a tomar la muestra cultivo faringeo

Ir en ayunas
● Sin aseo bucal
● SIn enjuage bucal
● Sin haber comido
● No haber estar tomando antibióticos (Si tomo antibióticos esperar 7 días)
Obtención de la muestra


1. Hisopo estéril y colocarnos junto al paciente (uno frente a otro) cerca de la llama de un mechero.
2. Pida al paciente que abra completamente la boca y con ayuda de un abatelenguas baje la lengua de su paciente.
3. Llevar el hisopo hasta la faringe posterior, frotar amígdalas o fosas amigdalinas y cualquier área de inflamación, exudación o ulceración.
4. Introducir el hisopos en tubo con caldo enriquecido e incubar 24 horas a 37.
5. Utilizando otro hisopo estéril, tome nuevamente una muestra de la región y con movimiento rotatorio extienda la muestra en un portaobjetos. Etiquete con su número de matrícula y fíjese a la flama del mechero.
6. Teñir este rotis con gram y observar con objetivo 100X

Placas utilizadas en cultivo faringeo

1. placa de agar sangre, agar chocolate, agar vogel-johnson.

1. Una vez terminado el periodo de incubación observar:


1. a)  En la placa de agar sangre:

1. Morfología de colonias crecidas y tipo de hemólisis presentada. A las colonias diferentes realizarles una tinción al Gram y observe la morfología bacteriana. Un frotis para Kinyoun.

\

* morfología de colonias y tipo de hemólisis, frotis al

Gram, resultados de pruebas de bacitracina y optoquina, prueba de

catalasa

1. En la placa de agar chocolate:

1. Morfología de colonias. Frotis al Gram de diferentes colonias. Si observa colonias sospechosas de ser Neisserias, coloque sobre ellas un disco taxo O, incube 30 min. la placa y observe si las colonias aparecen negras, de ser así son Neisserias

* morfología de colonias, frotis al gram y prueba de

oxidasa

1. En la placa de Agar Vogel Johnson:

1. Morfología de colonias y frotis. Efectúe la prueba de la coagulasa.

De color negro y el medio se observa amarillo

1. En la placa de agar sangre azida de sodio:

1. Morfología de las colonias y frotis de Gram. Además, inhibición de los discos Taxo A y Taxo PN. Además, frotis Kinyoun

0. PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA CULTIVO FARÍNGEO /PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN

AGAR CHOCOLATE

Neisseria sp.

Después de observar su morfología se le hace un gram y el resultado me debe dar diplococos gram negativos.

Luego una prueba de oxidasa/ Taxo O (Todas las Neisseria son oxidasa positiva).

Para conocer la especie de Neisseria se le hace una prueba de oxidación de carbohidratos.

Neisseria flava es la flora bacteriana normal.

0. PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA CULTIVO FARÍNGEO /PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN

AGAR SANGRE

Se observa morfología y hemólisis

Alfa: Hemólisis parcial color verde \n Beta: Hemólisis completa color transparente

Gamma: Sin hemólisis

Realizar un frotis de Gram y frotis para tinción Kinyoun

Si es un Streptococcus pyogenes es beta hemolítico, se ven cocos en cadena y es gram positivos.

Prueba catalasa: Negativa para Streptococcus pyogenes.

Si es Streptococcus Pneumoniae se ven diplococos gram positivos, y son Alfa hemolíticos.

0. PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA CULTIVO FARÍNGEO /PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN

AGAR AZIDA DE SODIO

\*También se observa morfología y se le hace gram.

A este Gram se le coloca

Taxo A: Bacitracina PARA Streptococcus pyogenes

Taxo PN: Optoquina PARA Streptococcus Pneumoniae.

Tenemos que medir los halos de inhibición alrededor de cada Taxo.

>15 mm alrededor de Bacitracina decimos que se trata de Streptococcus pyogenes.

> 18 mm alrededor de Optoquina se puede tratar de Streptococcus Pneumoniae.

0. PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA CULTIVO FARÍNGEO /PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN

AGAR VOGEL JOHNSON

Para Staphylococcus aureus

El agar tiene un color rosa pero el Staphylococcus aureus lo hace cambiar a color amarilo porque lo fermenta.

Amarillo= fermentó manitol

Este medio tmb tiene Telurito, esto hace que las colonias se vean de color negro

A las colonias negras se les hace Gram que da como resultado: Cocos en racimos gram positivos.

Catalasa para Staphylococcus aureus debe ser positiva

Prueba definitiva es la coagulasa: Positiva.

S. epidermidis: coagulasa negativa

alta concentracion de sal y manitol

PRUEBA COAGULASA

Las bacterias producen la enzima coagulasa por lo tanto tienen la facultad de coagular el plasma.

PRUEBA POSITIVA: Formación de coágulo de cualquier tamaño, en cualquier espacio del tubo

* Permite diferenciar Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) del resto de especies de Staphylococcus (coagulasa negativos)

PRUEBA CATALASA

El objetivo es diferenciar a los estreptococos de los estafilococos.

Su mecanismo es Los estafilococos producen catalasa, que convierte al peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno, los estafilococos son catalasa positivos y los estreptococos son negativos.

PRUEBA OXIDASA ( Taxo O)

El objetivo es Diferenciar Neisserias de Estreptococos y Estafilococos.

Su principio es demostrar la producción de la enzima indofenol - oxidasa.

El mecanismo es Las colonias de Neisserias se tornan púrpuras cuando la placa contiene una solución al 1 % de tetrametil - p - fenilendiamina. El microorganismo se mantendrá viable hasta 30 minutos después de la exposición al reactivo.

Bacitracina Taxo A

Se utiliza como una prueba de identificación de Streptococcus pyogenes.

Objetivo: Diferenciar los estreptococos del Grupo A positivos a la Bacitracina de otros estreptococos.

Principio: El crecimiento de los estreptococos del Grupo A (Streptococcus pyogenes), es inhibido por una pequeñísima cantidad de Bacitracina; por lo general no ocurre lo mismo con el crecimiento de otros estreptococos.

Mecanismo: Alrededor de un disco que contenga Bacitracina, se produce una zona de inhibición del crecimiento, de un diámetro de 15 mm por lo menos.

Optoquina Taxo PN

Objetivo: Diferenciar los neumococos positivos a la optoquina de los estreptococos alfa hemolíticos.

Principio: Demostrar la fragilidad de la membrana celular.

Mecanismo: El clorhidrato de etilhidrocupreína produce el lisado de los neumococos, los estreptococos alfa hemolíticos son resistentes a una concentración de 1:500 000. Se observa zona de inhibición alrededor del disco, con un diámetro de 18 mm.

cultivo faringeo= con acidos micolicos

* Mycobacterium - ácido micólico
* ●  Nocardia
* ●  Nocardia brasiliensis
* ●  Corynebacterium difteriae - Bacilos pequeños, forma de letras chinas, tienen ácidos

micólicos 30 carbonos, se colorean con gram

0. Aislamiento de S. pyogenes

Faringoamigdalitis


1. Cultivo faríngeo
2. Agar sangre → buscando Estreptococos beta hemolíticos
3. Incubar 48 horas a 35oC al aire
a. Beta hemolíticos
i. Cocos gram positivos y Catalasa negativa
4. Bacitracina positiva y PYR positiva → S. pyogenes ii. Bacilos gram positivos difteromorfos
b. No beta hemolíticos
i. Flora orofaríngea habitual

Aislamiento de S. aureus

1. Muestra inicial Caldo Tripticaseína y Soya
2. Agar Vogel Johnson → incubar a 37oC por 24 hrs
3. Colonias negras
a. Pruebas de la coagulasa positiva
i. S. aureus
b. Gram
i. Cocos en racimos
ii. Gram positivos

Aislamiento de Neisseria sp.

1. Muestra inicial. Caldo Tripticaseína y Soya
2. Agar chocolate → Incubar a 37oC por 24 horas
a. Gram
i. Diplococos gram negativos
b. Prueba de la oxidasa i. Positiva
c. Fermentación de carbohidratos
i. Identificación de especies de Neisserias

Aislamiento de S. pneumoniae

1. Muestra original
2. Agar sangre Azida de Sodio → Incubar a 37oC por 24 horas
a. TaxoA
i. Diámetro de inhibición de 15 mm
ii. S. pyogenes
b. Taxo PN (optoquina) → para diferenciar los neumococos de los
estreptococos alfa hemolíticos, así como demostrar la fragilidad de la membrana celular
i. Diámetro de inhibición 18 mm
ii. S. pneumoniae
c. Gram
i. Diplococos gram positivos

Agar sangre hemolisis

Alfa

beta

Gamma

alfa- s. pneumoniae o s. militis

beta- s, pyogenes o s. agalactae

gamma - otros streptococos y/o enterococos

Morfologia ENTEROBACTERIAS

TAMAÑO INTERMEDIO

* Antígeno común enterobacterias
* ●  Inmóviles o móviles con flagelos peritricos
* ●  No forman esporas
* ●  Anaerobios facultativos
* ●  Crecen rápidamente en medios no selectivos (agar sangre) y selectivos (agar

McConkey)
* ●  Aspecto mucoide (Klebsiella pneumoniae)
* ●  Fermentan glucosa

* Microorganismos como-------- se asocian a

enfermedades en el ser humano

* Salmonella Typhi, Shigella y Yersinia pestis

* se asocian a infecciones

oportunistas

*  Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Proteus mirabilis

Medios de cultivo:

● Agar desoxicolato

Es un agar selectivo para el aislamiento de: ■ Salmonella spp

■ Shigella spp

Medio Diferencial \n Se utiliza en medicamentos, alimentos, ambiente y muestras clínicas Sulfato y citrato férrico → hace que bacterias sean negras

Agar XLD

Medio moderadamente selectivo \n Se puede utilizar como medio para subcultivos a partir de caldo Selenite F.

BD Endo Agar

Medio ligeramente selectivo y de diferenciación para el aislamiento y la

diferenciación de la familia Enterobacteriaceae y diversos otros bacilos gram negativos a partir de muestras clínicas

EMB

* Colonias brillantes y opacas
* ○  Shigella, E.coli, Salmonella

MEDIOS DIFERENCIALES:

*  Agar de Desoxicolato
* ●  Agar EMB
* ●  Agar ENDO
* ●  Agar de Mac Conkey

0. MODERADAMENTE SELECTIVOS:

* Agar entérico Hecktoen
* ●  Agar S-S
* ●  Agar XLD

0. ALTAMENTE SELECTIVOS:

*  Agar de Sulfito Bismuto (Salmonella)
* ●  Agar Verde Brillante (Salmonella)
* ●  TCBS (Vibrio cholerae)

caldos enriquecidos

0. Los caldos de Selenito y los de Tetrationato son medios líquidos en donde la Salmonella se desarrolla bien durante las primeras 12 horas de incubación, un medio satisfactorio para Shigella es el caldo GN.

TSI

(triple azúcar hierro).

Investigar si la bacteria es capaz de utilizar la glucosa, sacarosa y/o lactosa como sustrato

Medio no inoculado: color rojo claro en su totalidad.

● Si la lactosa es fermentada: amarillo en el fondo y en la superficie.

● Si la sacarosa es fermentada: amarillo fondo y superficie.

● Si la glucosa es fermentada: amarillo el fondo y la superficie permanece roja.

● Si ningún azúcar es fermentado: el medio permanece rojo, pero más intenso que el no inoculado.

● Si hay producción de gas: durante la fermentación de los azúcares: formación de burbujas con quebraduras del agar en el fondo.

● Si se produce H2S: ennegrecimiento del medio en el fondo, debajo del medio, debido a la formación de FeS.

\

SIM

sulfuro indol motilidad):

Motilidad:
Positiva: turbiedad difusa o líneas de crecimiento apartándose de la línea de picadura.
Negativa: No se observa crecimiento a partir de la línea de picadura ni turbiedad.
Producción de H2S:
Positiva: ennegrecimiento del medio.
Negativa: el medio permanece de color amarillento.
Producción de Indol:


1. Agregue unas gotas del reactivo de Kovacs al medio de SIM
2. Agite y espere hasta que se forme un anillo en la superficie.
Positivo: Si se forma un anillo de color rojo. Negativo: Si el anillo que se forma es amarillo.

SIMMONS - CITRATO

Este medio es sólido, se presenta como agar inclinado de color verde. Tome un inóculo de la suspensión bacteriana con asa de picadura e inocule de la misma forma que el TSI.

\
Positiva: el medio cambia de color verde a color azul. \n Negativa: el medio permanece de color verde

CALDO UREA

Este medio se presenta como un caldo de color ROSA. Tome varias asadas de la suspensión bacteriana utilizando asa terminada en círculo, e inocule el caldo.

Positivo: si el medio vira de color Rosa a color Violeta. \n Negativo: si el medio permanece rosa.

VP Y ROJO DE METILO

Estos medios se presentan en estado líquido, color amarillento. Tome varias asadas de la suspensión bacteriana utilizando asa terminada en círculo e inocule en cada uno de ellos.

\
Positivo: se produce un color anaranjado que se va extendiendo de la superficie al fondo. \n Negativo: el caldo permanece amarillento.

Positivo: aparece un color anaranjado o rojo. Negativo: color amarillento.

AGAR LIA

(Agar hierro lisina): Utilizando el asa de picadura tome un inóculo de la suspensión bacteriana, introduzca el asa al tubo de medio LIA (agar inclinado violeta), hasta que toque el fondo del tubo y luego estríe toda la superficie del agar inclinado.

Positiva: Se presenta un color azul púrpura si es Salmonella y Arizona. \n Proteus y Providencia presentan color rojo anaranjado, y en el fondo se presenta producción de ácido que se manifiesta por un color amarillo debido a la desaminación de la lisina.

MEDIO MIO

Medio semisólido, se inocula con asa de picadura. Se toma una asada de la suspensión bacteriana utilizando asa de picadura, introduzca el asa hasta 1 cm por debajo de la superficie del medio semisólido y sáquela en la misma línea por donde entró el asa bacteriológica.

\
Movilidad: \n Positiva: Se presenta enturbiamiento \n Negativa: Se presenta crecimiento sobre la picadura

Ornitina descarboxilasa: \n Positiva: Se presenta un color púrpura Negativo: Se presenta color amarillo en el fondo

Indol con reactivo de Kovacs: Positiva: Rosa o rojo con el reactivo Negativo: Sin cambio de color

* Placa de EMB →
* ●  Placa de S-S →
* ●  Caldo de Tetrationato →
* ●  TSI →
* ●  SIM →
* ●  Simmons - Citrato →
* ●  Caldo Urea →
* ●  VP y Rojo de Metilo→
* ●  Agar LIA →
* ●  Medio MIO →
* ●  Agar Verde Brillante →

* Placa de EMB → Diferencial
* ●  Placa de S-S → Selectivo
* ●  Caldo de Tetrationato → Selectivo
* ●  TSI → Diferencial (Enterobacterias)
* ●  SIM → Diferencial
* ●  Simmons - Citrato → Selectivo y diferencial
* ●  Caldo Urea → Diferencial
* ●  VP y Rojo de Metilo→ Diferencial
* ●  Agar LIA → Diferencial
* ●  Medio MIO → Diferencial
* ●  Agar Verde Brillante → Selectivo

0. Es posible diferenciar Salmonella de Shigella por

presencia de flagelos

0. La enzima microbiana triptofanasa

0. cataliza el triptófano y libera indol