D5 Cytokinen

paar slides aanvullen

welke cytokine- en chemokine receptorfamilies zijn er?

1. immunoglobulin familie receptor

2. hematopoietine-type receptoren

3. interferon-type receptoren

4. TNF receptoren

5. IL-17 receptoren

6. chemokine receptoren

wat zijn de kenmerken van cytokinen?

1. = kleine (<30kDa) eiwitten

2. verschillende celsignalisering mogelijk

   1. meestal paracrien

   2. meestal autocrien

   3. soms endocrien

3. verschillende manieren van werken

   1. synergie

   2. pleiotropie

   3. antagonisme

   4. redundantie

4. geproduceerd door diverse cellen

5. binden met zeer hoge affiniteit op specifieke receptoren → werken al aan picomolaire concentraties

6. w altijd in cascade geproduceerd (nooit alleen geproduceerd, altijd meerdere cytokines)

aan wat voor soort celsignalisering doen cytokinen?

1. meestal autocrien: op eigen cel

2. meestal paracrien: op naburige cellen

3. soms endocrien: cellen ver weg

welke cytokines hebben een autocriene werking?

1. IL-2

welke cytokines hebben een paracriene werking?

1. IL-12 van macrofaag → werkt in op naïeve T-cel → differentiatie tot Th1

welke cytokines hebben een endocriene werking?

1. IL-1: werkt in op hypothalamus

IL-1 wordt ook wel … genoemd, waarom?

pyrogen: IL-1 heeft een endocriene werking: werkt in op hypothalamus en veroorzaakt koorts

op welke ‘manieren’ kunnen cytokinen werken?

1. pleiotropie

2. redundantie

3. synergie

4. antagonisme

wat betekent pleiotropie

1 cytokine heeft meerdere effecten op verschillende celsoorten (meerdere targetcellen)

wat betekent redundantie

verschillende cytokines hebben zelfde effect

wat betekent synergie?

effect van 2 cytokines versterken elkaar

wat betekent antagonisme?

cytokine 1 werkt effect van cytokine 2 tegen

voorbeeld pleiotrope cytokines

IL-4:

1. B-cel: activatie, proliferatie, differentiatie

2. thymocyt: proliferatie

3. mast-cel: proliferatie

voorbeeld redundante cytokines

1. IL-2

2. IL-4

3. IL-5

→ proliferatie B-cel

voorbeeld synerge cytokines

IL-4 + IL-5

1. B-cel: klasse switch naar IgE

voorbeeld antagonistische cytokines

IFN-gamma blokeert IL-4 → blokkeer klasse switch van B-cel naar IgE (normaal door IL-4 geinduceerd)

leg een experiment uit waarbij er het bewijs van synergie en antagonisme (dat proteine specifiek is) bij cytokinen wordt getoond

→ synergie tsn IL-17 en TNF-α, en van antagonisme met IFN-γ

1. MEF (muis embryonale fibroblasten) 48u stimuleren met:

   1. enkel IL-17

   2. enkel TNF-α

   3. IL-17 + TNF-α

   4. → allemaal met of zonder IFN-γ

2. effecten bekijken (van boven naar onder)

   1. bovenste rij (GCP2 mRNA/eiwit) en middelste rij (IL6 mRNA/eiwit)

      1. IL-17 + TNF-α samen → veel meer dan de som = synergie (versterken elkaar)

      2. IL-17 + TNF-α + IFN-γ → synergisch effect wordt geblokkeerd door IFN-γ = antagonisme

   2. onderste rij (RANKL mRNA/eiwit)

      1. niet hetzelfde effect → bewijst dat synergisch/antagonistisch effect target/proteine specifiek is!

3. waarom mRNA en eiwitproductie beiden bekijken? → genexpressie en eiwitproductie komen niet altijd overeen → zien op beide niveau’s effect van synergie/antagonisme

(grafieken links: mRNA aka genexpressie, rechts: effectieve eiwitproductie.

(grafieken boven: granulocyt chemotactische factor (GCP), midden: IL-6, onder: RANKL)

wat is de klinische toepassing van het synergisch effect?

1. IL-17 + TNF-α hebben synergisch (versterkend) effect op elkaar voor IL-6 productie

2. IL-6 is inflammatoir cytokine → zit in synoviaal vocht reumapatiënt (samen met IL-17 + TNF-α)

3. behandeling met anti-TNF: neemt synergisch effect op IL-6 productie weg!

wat wordt bedoeld met cascade inductie van cytokines?

cytokines worden altijd tezamen, nooit allen geproduceerd

welke cytokines behoren tot de innate/aangeboren immuniteit?

1. IL-1

2. TNF-alfa (tumor necrosis factor alfa)

3. IL-12

4. IL-6

5. IFN-alfa (interferon alfa) (familie)

6. IFN-béta

welke cytokines horen tot de adaptive immuniteit?

1. IL-2

2. IL-4

3. IL-5

4. TGF-bèta (transforming growth factor bèta)

5. IFN-gamma (interferon gamma)

door wat wordt IL-1 gesecreteerd?

1. monocyten

2. macrofagen

3. endotheliale cellen

4. epitheel cellen

door wat wordt TNF-alfa gesecreteerd?

1. macrofagen

2. monocyten

3. neutrofielen

4. geactiveerde T-cellen

5. NK cellen

door wat wordt IL-12 gesecreteerd?

1. macrofagen

2. dendritische cellen

door wat wordt IL-6 gesecreteerd?

1. macrofgen

2. endotheliale cellen

3. Th2 cellen

door wat wordt IFN-alfa (familie van moleculen) gesecreteerd?

1. macrofagen

2. dendritische cellen

3. virus-geïnfecteerde cellen

door wat wordt IFN-bèta gesecreteerd?

1. macrofagen

2. dendritische cellen

3. virus-geïnfecteerde cellen

door wat wordt IL-2 gesecreteerd?

1. T cellen

door wat wordt IL-4 gesecreteerd?

1. Th2 cellen

2. mast cellen

door wat wordt IL-5 gesecreteerd?

1. Th2 cellen

door wat wordt TGF-bèta gesecreteerd?

1. T cellen

2. macrofagen

3. andere celtypes

door wat wordt IFN-gamma gesecreteerd?

1. Th1 cellen

2. CD8+ cellen

3. NK cellen

wat zijn de targets en effecten van IL-1

1. vasculatuur (inflammatie)

2. hypothalamus (koorts)

3. lever (inductie van acute fase eiwitten)

wat zijn de targets en effecten van TNF-alfa

1. vasculatuur (inflammatie)

2. lever (inductie van acute fase eiwitten

3. verlies van spieren, vetweefsel = cachexie

4. inductie sterven versch celtypes

5. activatie neutrofielen

wat is cachexie?

verlies van spierweefsel en ernstige vermagering door bv kanker

wat zijn de targets en effecten van IL-12

1. NK cellen

2. beïnvloedt adaptive immunity (promoten van Th1 subsets)

wat zijn de targets en effecten van IL-6

1. lever (inductie van acute fase eiwitten)

2. beïnvloedt adaptive immunity (proliferatie en antilichaam secretie B-cellen)

wat zijn de targets en effecten van IFN-alfa (familie van molecules)

1. induceert antivirale staat in meeste cellen met celkern

2. verhoogde expressie van MHCI

3. activatie NK cellen

wat zijn de targets en effecten van IFN-bèta

1. induceert antivirale staat in meeste cellen met celkern

2. verhoogde expressie van MHCI

3. activatie NK cellen

wat zijn de targets en effecten van IL-2

1. proliferatie T-cellen

2. activatie en proliferatie NK cellen

3. proliferatie B-cellen

4. AICD promoten

wat is AICD?

= Activation Induced Cell Death → apoptose van T-cellen na stimulatie met IL-2

wat zijn de targets en effecten van IL-4

1. promoten Th2 differentiatie

2. isotype switch naar IgE

wat zijn de targets en effecten van IL-5

1. activatie eosinofielen

2. genereren eosinofielen

wat zijn de targets en effecten van TGF-bèta

1. inhibeert T-cel proliferatie en hun effector functies

2. inhibeert B-cel proliferatie

3. inhibeert macrofagen

4. isotype switch naar IgA

wat zijn de targets en effecten van IFN-gamma

1. activatie macrofagen

2. verhoogde expressie MHCI en MHCII

3. verhoogde antigen presentatie

welke cytokinefamilies zijn er?

1. interleukine 1 familie

2. hematopoietine familie

3. interferon familie

4. tumor necrosis familie

5. interleukine 17 familie

6. chemokines

welke cytokines behoren tot interleukine 1 familie?

1. IL-1alfa

2. IL-1bèta

3. IL-1Ra

4. IL-18

5. IL-33

welke cytokines behoren tot de hematopoietine familie?

1. IL-2

2. IL-3

3. IL-4

4. IL-5

5. IL-6

6. IL-7

7. IL-12

8. IL-13

9. IL-15

10. IL-21

11. IL-23

12. GM-CSF

13. G-CSF

welke cytokines behoren tot de interferon familie?

1. IFN-alfa

2. IFN-bèta

3. IFN-gamma

4. IL-10

5. IL-19

6. IL-20

7. IL-22

8. IL-24

welke cytokines behoren tot de tumor necrosis factor familie?

1. TNF-alfa

2. TNF-bèta

3. CD40L

4. FasL

5. BAFF

6. APRIL

7. LTbèta

welke cytokines behoren tot de interleukine 17 familie

1. IL-17 (A, B, C, F)

welke cytokines behoren tot de chemokines?

1. IL-8

2. CCL19

3. CCL21

4. RANTES

5. CCL2

6. CCL3

op welke manieren kunnen we in het labo cytokines detecteren?

1. ELISA (zie hoofdstuk over toepassingen)

2. multiplex arrays

3. ELISPOT

4. Bioassay

5. intracellulaire kleuren en flowcytometrie

6. immunocytochemie

wat zijn multiplex assays?

→ meerdere soorten cytokinen tegelijk meten, weinig staal nodig, maar duur

1. beads gekoppeld aan antilichamen tegen specifieke cytokinen → elke bead heeft unieke kleurcode (weten welk cytokine) (cytokine bead array, CBA)

2. staal wordt toegevoegd → cytokinen binden aan hun specifiek antilichaam

3. detectie-antilichaam (met fluorescent label) bindt aan cytokine (weten hoeveel cytokinen)

4. meting via flowcytometrie → laser leest kleur van bolletje + hoeveelheid fluorescent signaal

wat is ELISPOT?

→ detectie van in vitro cytokine-producerende-cellen (levende cellen)

1. plaat coaten met antilichaam tegen bepaald cytokine

2. levende cellen op plaat zetten en stimuleren

3. cellen die het cytokine produceren → cytokine wordt direct opgevangen door het antilichaam op plaat

4. detectie-antilichaam (met label) bindt aan het opgevangen cytokine

5. elke cel die het cytokine produceerde vormt een spot op de plaat (elke spot = een cel)

wat is BIOASSAY?

→ detectie van ACTIEF cytokine dmv levende cellen (<-> ELISA: (in)actief cytokinen)

1. gebruikt cellen die afhankelijk zijn van werking cytokine: bv cellen + virus + staal met cytokine dat virus(werking) doodt (bv IFN)

2. meten hoeveel cellen groeien/overleven → indicatie van biologische activiteit van cytokinen

3. meer groei/overleving = meer actief cytokinen

(paars: levende cellen, kleurloos: dode cellen)

wat is FACS en hoe werkt het?

FACS = gespecialiseerde vorm van flow cytometrie (Fluorescence-Activated Cell Sorting)

kan via…

1. cytokine bead array (CBA) zie slide over multiplex assay

2. intracellulaire kleuring:

   1. cellen kleuren met

      1. CD11b = macrofaag marker

      2. anti-TNF antilichaam → detecteert TNF binnen de cel

   2. via FACS meten: welke cellen zijn CD11b+ én anti-TNF+

   3. → detecteren zo cellen die TNF produceren

3. controle

   1. irrelevant IgG antilichaam toevoegen → bindt altijd beetje aspecifiek (=achtergrondruis)

   2. percentage anti-TNF+ min controle → toont echt TNF signaal

4. wel beperkingen: werkt niet voor elk cytokine

slide over spec receptoren en natuurlijke inhibitors

normale pathway:

1. IL-1 bindt aan IL1RI (IL-1 receptor)

2. rekrutering van IL-RAcP (IL-1 receptor Accessory protein)

3. ILRI en IL-RAcp dimeriseren → signalisatie tot activering via TIR domeinen

dmv IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra): Anakinra

1. IL-1Ra = gemuteerde vorm van IL-1

2. IL-1Ra bindt IL-RI → MAAR: geen rekrutering van IL-RacP

3. → geen dimerisatie → geen activatie (minder ontsteking)

4. = medicatie voor systemische idiopatische juvenile arthritis

wat is een mogelijke behandeling tegen juvenile idiopathische arthritis?

→ Anakinra: IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra)

normale pathway:

1. IL-1 bindt aan IL1RI (IL-1 receptor)

2. rekrutering van IL-RAcP (IL-1 receptor Accessory protein)

3. ILRI en IL-RAcp dimeriseren → signalisatie tot activering via TIR domeinen

dmv IL-1 receptor antagonist (IL-1Ra): Anakinra

1. IL-1Ra = gemuteerde vorm van IL-1

2. IL-1Ra bindt IL-RI → MAAR: geen rekrutering van IL-RacP

3. → geen dimerisatie → geen activatie (minder ontsteking)

hoe kan een IL-2 receptor er uit zien?

1. common gamma chain + bèta keten → intermediaire affiniteit

2. common gamma chain + bèta + alfa keten → hoogste affiniteit

3. alfa keten → lage affiniteit

wat is de receptor met de hoogste affiniteit die bestaat in de immunologie?

IL-2 receptor met de drie ketens: alfa + gamma + bèta keten

wat wordt bedoeld met de common gamma chain?

= keten die bij verschillende cytokine receptoren voorkomt: receptoren van de IL-2 receptor subfamilie

bij welke cytokinereceptoren komt de common gamma chain voor?

1. IL-2

2. IL-4

3. IL-7

4. IL-9

5. IL-15

bij welke cellen komen IL-2R met enkel de gamma en bèta keten voor?

1. NK cellen

2. rustende T-cellen

bij welke cellen komen IL-2R met oftewel alfa, oftwel alle drie (gamma, alfa, bèta) ketens voor?

1. geactiveerde CD4+ en CD8+ T-cellen

2. geactiveerde B-cellen

wat gebeurt er als er een mutatie is in de common gamma chain?

1. kunnen receptoren van IL2R familie niet aanmaken → T, B, NK cellen ontbreken → zeer immunodefficiënt (moet in steriele omgeving blijven (‘bubble boy’))

2. = X gebonden Severe Combined Immuno Defficiency (X-SCID)

(ondertussen wel gentherapie mogelijk)

wat is X-SCID?

1. = Severe Combined Immuno Defficiency

2. komt voor als men mutatie in common gamma chain heeft: kunnen receptore van IL2 receptor familie niet meer aanmaken → geen B-, T-, NK cellen

hoe komt het dat sommige cytokines dezelfde effecten hebben? geef een voorbeeld van zo’n groep

→ GM-CSF receptor subfamily: hebben allemaal common β subunit (=receptoren van cytokinen)

1. α ketens: bindende subunits → specifiek aan cytokine dat receptor bindt

2. β ketens: noodzakelijk voor signaaltransductie (activatie van tyrosine kinasen)

3. zelfde β ketens → overlappende activiteiten

   1. groeifactoren voor progenitorcellen

   2. activatie monocyten

   3. degranulatie basofielen

4. → redundantie (=meer dan nodig): als er een bepaald cytokine wegvalt, kunnen andere cytokines die taak overnemen

hoe gebeurt de binding van een cytokine aan een receptor?

1. eerst aan bindende keten (meestal alfa) met lage affiniteit

2. associatie bèta keten → hoge affiniteit

wat is een mogelijke verklaring voor reduntante of antagonistische karakter van cytokinen?

→ het gebruik van eenzelfde subunit:

1. alfa en bèta ketens komen los van elkaar voor op celmembraan, en beta keten is in mindere mate aanwezig op celmembraan

2. cytokine bindt eerst bindende (meestal alfa) keten, dan wordt bèta keten gerekruteerd

→ cytokine 2 toedienen na cytokine 1, kan zijn dat er geen bèta keten meer gerekruteerd kan worden

hoe verloopt de signaaltransductie na binding van een cytokine?

1. binding cytokine met alfa subunit

2. dimerisatie receptor

3. activatie JAKs (Janus Activating Kinases) → gaan tyrosines fosforyleren

4. bidning en activatie van STAT eiwitten (Signal Transducers and Activators of Transcription)

5. STATs komen los van receptor, dimeriseren en migreren naar nucleus

hoe ontstaat de specificiteit van cytokines?

1. specifieke JAKs en STATs

2. herkenning van verschillende sequentiemotieven in het DNA, door STAT-homo/heterodimeren

welke JAK en STAT worden geactiveerd door IFN-alfa/bèta receptor?

1. JAK 1 + Tyk 2 (dimeer)

2. STAT 1 + 2

welke JAK en STAT worden geactiveerd door IFN-gamma receptor?

1. JAK 1 + JAK 2 (dimeer)

2. STAT 1 + STAT 1

welke JAK en STAT worden geactiveerd door IL-2 receptor?

1. JAK 1 + JAK 3

   1. vooral STATs 3 en 5, ook STAT1

welke JAK en STAT worden geactiveerd door IL-4 receptor?

1. JAK 1 + JAK 3

2. vooral STAT 6, ook STAT5

welke JAK en STAT worden geactiveerd door IL-6 receptor?

1. JAK 1 + JAK 2

2. STAT 3 + STAT 3

welke JAK en STAT worden geactiveerd door IL-7 receptor?

1. JAK 1 + JAK 3

2. STATs 5 en 3

wat is Filgotinib

een JAK1 inhibitor → zorgt bij overmatige immuunreactie dat deze wordt getemperd (bv rheuma)

geef voorbeelden van cytokine gebaseerde of anti-cytokine gebaseerde therapieën

Etanercept/enbrel	Chimere TNF-receptor -> vangt TNF op voordat het aan 'normale' receptor bindt (=TNF antagonist)	Rheumatoide arthritis
Remicade	Antilichaam tegen TNF-alfa receptor (=TNF antagonist)	Rheumatoide arthritis, ziekte van Crohn
	Interferon-beta-1b	Multiple sclerose
	Interferon-beta-1a	Multiple sclerose
Anakinra (kineret)	Recombinant IL-1Ra -> normale IL-1 pathway onderbroken (geen dimerisatie) -> geen activatie	Rheumatoide arthritis, systemische juvenile idiopatische arthritis
Daclizumab (Zenapax)	Gehumaniseerd antilichaam tegen alfa keten van IL-2R	Tegen verstoting bij transplantaties

hoe werkt Daclizumab?

→ blokkeert geactiveerde T-cellen en werd gebruikt bij behandeling van MS

1. antistof tegen alfa keten van IL-2R → hoge en lage affiniteits IL-2R geblokkeerd (= die die op T-cellen komen)

2. neveneffecten: IL-2R met intermediaire affiniteit niet geblokkeerd (heeft geen alfa keten) → zware activatie van NK cellen (want die hebben deze receptor wel)

wat zijn goede mediacties tegen de behandeling van rheumatoide arthritis?

→ TNF antagonisten

1. Enbrel/Etanercept → chimere TNF-receptor -> vangt TNF op voordat het aan 'normale' receptor bindt

2. Remicade → antilichaam tegen TNF-alfa receptor