Tema 6: Técnicas generales de preparación de muestras biológicas para la observación de células y tejidos con microscopía electrónica

Técnica de las secciones ultrafinas contrastadas (tinción positiva):

ETAPAS

1. Disección

2. Fijación

   1. Fijación primaria: glutaraldehído → proteínas.

   2. Lavado.

   3. Fijación secundaria: tetróxido de osmio → lípidos.

3. Obtención de secciones ultrafinas

4. Contraste de las secciones

Obtención de secciones ultrafinas

1. Inclusión: Puede hacerse con resinas epoxi o acrílicas a baja temperatura. Se divide en varias etapas:

   1. Deshidratación: acetona.

   2. Aclarante: óxido de propileno.

   3. Infiltración: inclusión en resina.

   4. Confección del bloque.

2. Ultramicrotomía: Con ultramicrotomo, cuchillas de diamante. Se obtienen muestras ultrafinas (60-80nm). Se recogen en rejillas de niquel o cobre.

Propiedades de un medio de inclusión para M.E.T.

1. Solubilidad en el agente aclarante.

2. Buena calidad de sección

3. Estabilidad y transparencia frente al haz de electrones.

Contraste de las secciones

Puede ser

• Contraste positivo: equivalente a tinción MO. Más habitual.

• Se pretende intensificar la capacidad de dispersión con la adición de metales pesados.

• Dependiendo de la diferente afinidad de los metales, se producen imágenes más electrodensas (oscuras) o electrolúcidas (claras).

2 formas de hacer contraste:

• En bloque: post fijación y antes de inclusión

• En rejillas: tras fijación, inclusión o corte, se ponen gotitas encima de las rejillas.

Etapas de preparación de muestras para MET

Técnicas de tinción negativa

Tras la fijación, el material es embebido en una solución líquida de contraste que rodea a las partículas. Al secarse forma una película muy densa a los electrones que rodea y delimita a las partículas.

Muy usada para virus.

Criotécnicas

Buscan reducir los cambios introducidos por la fijación química. Todas comienzan con una criofracción. Muy buena para el estudio de membranas (pelas la membrana de la célula).

Muestras tridimensionales secadas con la técnica del punto crítico y revestidas con una capa metálica (MEB)

Condiciones de MEB: muestras secas y conductoras.

Etapas:

1. Fijación en glutaraldehído

2. Postfijación en tetraóxido de osmio

3. Lavado

4. Deshidratación en acetona o etanol

5. Secado (Técnica de punto crítico)

6. Metalizado con oro

7. Observación