Extracción de ADN y Biología Molecular

Tarjetas de estudio basadas en las lecturas de extracción de ADN, reactivos, cuantificación y conceptos clave de biología molecular.

¿Qué es la extracción de ADN y cuáles son sus propiedades químicas clave?

Es el proceso para aislar y purificar el material genético de una muestra biológica, separándolo de contaminantes. El ADN es polar y posee un esqueleto con carga negativa ($PO_4^{3-}$) que interactúa con cationes ($Na^+$) para modificar su solubilidad.

¿Cuáles son las 4 etapas fundamentales en el proceso de extracción de ADN?

I. Lisis de las células y liberación del ADN, II. Extracción/Purificación de proteínas y lípidos con solventes orgánicos, III. Precipitación del ADN, y IV. Recuperación de ADN.

¿Cuál es el rango aceptable de pureza del ADN medido mediante la relación de absorbancia $A_{260}/A_{280}$?

Un rango de pureza aceptable se ubica entre $1.8$ y $2.0$. Un valor menor a $1.6$ indica contaminación por proteínas u otros compuestos.

¿Cómo se comparan los mecanismos y la toxicidad de la extracción orgánica frente a la inorgánica (Salting Out)?

La extracción orgánica usa solventes orgánicos (fenol y cloroformo) para separar fases y presenta mayor toxicidad. La extracción inorgánica utiliza alta fuerza iónica ($NaCl$) para precipitar proteínas de forma selectiva y tiene menor toxicidad.

¿Cuál es la función del Buffer de Lisis en la extracción de ADN?

Rompe la bicapa lipídica de la membrana plasmática, nuclear y eritrocitos para liberar el contenido celular, utilizando detergentes como el $SDS$ y sales.

¿Qué papel cumple la Proteinasa K durante la purificación del ADN?

Es una enzima proteolítica activa que digiere histonas, nucleasas y proteínas estructurales. Degrada tejidos para facilitar la purificación e inactiva enzimas que dañarían el ácido nucleico.

¿Cuál es el fundamento químico del Cloruro de Sodio ($NaCl$) en la extracción de ADN?

Aumenta la fuerza iónica. Los cationes $Na^+$ interactúan con las cargas negativas de los grupos fosfato del ADN, neutralizándolo y favoreciendo su precipitación y recuperación selectiva.

¿Qué funciones cumplen el fenol y el cloroformo en la extracción orgánica?

El fenol desnaturaliza y extrae proteínas haciéndolas insolubles en agua. El cloroformo favorece la separación nítida de las fases acuosa y orgánica, arrastrando componentes hidrofóbicos a la fase orgánica (inferior).

¿Cuál es la función del Alcohol Isoamílico en la mezcla con fenol y cloroformo?

Es un agente antiespumante que estabiliza la interfase entre la fase acuosa y la fase orgánica.

¿Cómo actúan el Isopropanol y el Etanol en la fase de precipitación del ADN?

Disminuyen la constante dieléctrica del medio, deshidratan la molécula de ADN y provocan su precipitación. El etanol se usa además para lavar el ADN precipitado y eliminar sales residuales.

¿Qué función desempeñan los componentes del Buffer TE (Tris-EDTA)?

Resuspende y conserva el ADN. El Tris mantiene el pH estable y el EDTA quelata cationes divalentes ($Mg^{2+}$, $Ca^{2+}$), lo que inactiva a las DNAsas y protege la integridad del ADN.

¿En qué fases se separan las moléculas al centrifugar la mezcla de extracción orgánica?

En tres fases: la Fase Acuosa (superior/hidrofílica, contiene ADN), la Interfase (media, proteínas desnaturalizadas) y la Fase Orgánica (inferior/hidrofóbica, contiene lípidos y solventes).

¿Qué diferencia química en el carbono 2' existe entre la Ribosa y la Desoxirribosa?

La desoxirribosa tiene un átomo de oxígeno menos que la ribosa; presenta un grupo $-H$ en el carbono 2', mientras que la ribosa presenta un grupo $-OH$.

¿Cómo se clasifican las bases nitrogenadas en Purinas y Pirimidinas?

Las Purinas son la Adenina ($A$) y la Guanina ($G$). Las Pirimidinas son la Citosina ($C$), la Timina ($T$, exclusiva del ADN) y el Uracilo ($U$, exclusivo del ARN).

¿Qué tipo de enlace une la base nitrogenada con el azúcar pentosa y en qué carbono se realiza?

Es un enlace N-glucosídico que conecta la base nitrogenada al carbono 1' ($C1'$) del azúcar.

¿Qué enlace une los nucleótidos individuales para formar cadenas y entre qué posiciones se forma?

El enlace fosfodiéster, un enlace covalente fuerte entre el grupo fosfato ubicado en el carbono 5' ($C5'$) de un nucleótido y el carbono 3' ($C3'$) del siguiente nucleótido.

¿Cuáles son las partes constitutivas fundamentales de un nucleótido?

Un grupo fosfato, un azúcar pentosa y una base nitrogenada.

¿En qué se diferencia un nucleótido de un nucleósido?

Un nucleósido consiste únicamente en una base nitrogenada unida a un azúcar pentosa. Un nucleótido es un nucleósido unido a un grupo fosfato.

¿Cuántos puentes de hidrógeno unen los pares de bases A-T y G-C, y cuál es más estable?

El par Adenina-Timina ($A-T$) se une mediante 2 puentes de hidrógeno, mientras que Guanina-Citosina ($G-C$) se une mediante 3 puentes de hidrógeno. El par $G-C$ es el más estable térmicamente.

¿Cómo es la estructura tridimensional y organización del ADN en células eucariotas?

Forma una doble hélice dextrógira con dos hebras antiparalelas orientadas en direcciones $5' \nrightarrow 3'$ opuestas. En eucariotas, el ADN se enrolla alrededor de proteínas histonas para formar 46 cromosomas (23 pares).

¿Cuáles son los tipos de ARN celular y su porcentaje de abundancia?

ARN mensajero (ARNm, $3\text{--}5*\%$ del total), ARN de transferencia (ARNt, $5\text{--}7*\%$ del total) y ARN ribosómico (ARNr, el más abundante con el $80*\%$ del total).

¿A qué concentración de ADN equivale una lectura de absorbancia de $1$ a $260\,nm$ ($A_{260} = 1$)?

Equivale a una concentración de $50\,\mu g/mL$ de ADN de cadena doble.

¿Qué diferencia existe entre el sitio de corte de las endonucleasas y las exonucleasas?

Las endonucleasas cortan la cadena de ADN/ARN en puntos internos, generando fragmentos internos. Las exonucleasas cortan progresivamente desde los extremos de la cadena hacia el interior.

¿Cómo se diferencian las Enzimas de Restricción Tipo I y Tipo II?

Las de Tipo I cortan en sitios cercanos pero no exactos al sitio de reconocimiento. Las de Tipo II cortan justo en el sitio de reconocimiento específico (palíndromo) y son las más usadas.

¿Qué diferencia existe entre un corte con extremos cohesivos y un corte con extremos romos?

Los extremos cohesivos (o pegajosos) se generan por un corte desplazado que deja salientes de cadena simple. Los extremos romos ocurren por un corte exactamente en la misma posición en ambas cadenas.

¿Cuál es la función del Isotiocianato de Guanidina en la extracción de ARN?

Es un inhibidor potente de ARNasas que destruye las nucleasas y protege la integridad del ARN durante la lisis celular.

¿Qué función cumplen las sales caotrópicas en la purificación mediante columnas de sílice?

Destruyen la capa de hidratación del ácido nucleico, permitiendo que se una selectivamente a la membrana de sílice o a perlas magnéticas mientras los contaminantes no se fijan.

¿Cuál es la función de la Transcriptasa Inversa?

Es una ADN polimerasa dependiente de ARN que sintetiza una cadena de ADN complementario (ADNc) a partir de un molde de ARN.

¿Qué reactivo se utiliza para desparafinizar tejidos fijados antes de la digestión enzimática?

El xileno o lavados con etanol, los cuales disuelven y eliminan la parafina antes de digerir el tejido con Proteinasa K.

¿Cuál es la función del Bromuro de Etidio en la electroforesis?

Se intercala entre las bases nitrogenadas del ADN/ARN y emite fluorescencia bajo luz ultravioleta (UV), permitiendo visualizar y revelar las bandas.