Moleculaire biologie H4

Genexpressie bij eukaryoten

Leg uit hoe de core promotor van een eukaryoot gen is opgebouwd. Welke elementen kunnen aanwezig zijn en wat is hun functie?

De core promotor van een eukaryoot gen is de DNA-regio die direct verantwoordelijk is voor het initiëren van transcriptie door RNA-polymerase II. Ze bevat een combinatie van conserveerde sequentie-elementen, die elk een specifieke functie hebben:

1. BRE (TFIIB Recognition Element)

   • Wordt herkend door de transcriptiefactor TFIIB.

   • Bestaat uit twee varianten: BREu (upstream) en BREd (downstream van de TATA-box).

   • Speelt een rol in het positioneren van RNA-pol II via TFIIB.

2. TATA-box (Hogness-box)

   • AT-rijke sequentie, meestal gelegen rond -25 tot -30 bp ten opzichte van het transcriptie startpunt.

   • Wordt herkend door TBP (TATA-binding protein), onderdeel van het TFIID-complex.

   • TBP-binding buigt het DNA (~80-90°), waardoor de dubbele helix lokaal opent.

3. Inr (Initiator element)

   • Bevindt zich rond +1, het startpunt van transcriptie.

   • Vaak begint transcriptie bij een A-residu binnen de Inr.

   • Werkt vaak samen met DPE in TATA-loze promotors.

4. MTE (Motif Ten Element)

   • Bevindt zich tussen +18 en +27.

   • Versterkt transcriptie en helpt bij de binding van TFIID.

5. DPE (Downstream Promoter Element)

   • Bevindt zich stroomafwaarts van +1, meestal rond +28 tot +32.

   • Essentieel voor transcriptie-initiatie in promotors zonder TATA-box, en werkt samen met Inr.

🧠 Sommige promotors bevatten ook:

• DCE (Downstream Core Element): overlapt met MTE/DPE.

• XCPE1: een specifiek core element voor bepaalde TATA-loze promotors.

Wat is het verschil tussen proximale en distale regulerende elementen? Geef van elk twee voorbeelden en leg hun werking uit.

De regulerende elementen van een gen kunnen worden ingedeeld op basis van hun locatie ten opzichte van het transcriptiestartpunt:

🔹 Distaal gelegen regulerende elementen (vaak 100s tot 1000s bp weg van het gen):

1. Enhancers

   • DNA-sequenties die transcriptie activeren.

   • Kunnen ver stroomopwaarts of stroomafwaarts van een gen liggen, zelfs in introns of op andere chromosomen.

   • Werken via binding van activator-eiwitten.

   • Door DNA-looping (bv. via CTCF-cohesine complex, bevat 11 Zn-vinger motieven type 1) wordt het enhancer-gebonden activator eiwit naar de core promotor gebracht.

   • Voorbeeld: responsieve elementen zoals CRE, GRE.

2. Silencers

   • DNA-elementen die transcriptie onderdrukken.

   • Werken door binding van repressoren, die de assemblage van het transcriptie-initiecomplex verhinderen.

   • Kunnen ook chromatine in heterochromatische toestand brengen via co-repressoren (bv. HDAC’s).

🔹 Proximaal gelegen regulerende elementen (meestal -50 tot -200 bp upstream van +1):

Deze liggen vlak vóór de core promotor en beïnvloeden de basale transcriptie-efficiëntie.

Bekende voorbeelden:

• GC-box → bindt SP1 = selectieve promotor factor 1, bevat in DBD drie Zn-vinger motieven type 1

• CCAAT-box (sequentie: GGCCAATCT) → bindt C/EBF bevat leucine zipper motief waardoor het kan demiriseren of C/EBP

• OCT-box → bindt Octamer Transcription Factor-1 (OTF1)

Eigenschappen:

• Liggen in cis (dus op hetzelfde DNA-molecuul als het gen dat ze reguleren).

• Worden gebonden door specifieke transcriptiefactoren die vaak een zinkvinger- of leucine zipper-DNA-bindingsmotief bevatten.

• Reguleren “housekeeping”-genen en weefsel-specifieke genexpressie.

🧠 Extra tip:

Locatie	Elementen	Effect
Proximaal (-50 tot -200)	GC-box, CCAAT-box, OCT-box	Fijnregeling van basale transcriptie
Distaal (> ±500 bp)	Enhancer, Silencer, Responsieve elementen	Activatie of repressie op afstand

Beschrijf de opbouw en functie van het pre-initiation complex (PIC) bij transcriptie. Welke factoren zijn betrokken en wat is hun volgorde van binding?

Wat is het verschil tussen een activator, een co-activator en een algemene transcriptiefactor? Geef een concreet voorbeeld van elk.

🧬 1. Algemene transcriptiefactor (GTF)

🔹 Definitie:
Algemene transcriptiefactoren zijn essentiële eiwitten die nodig zijn om het pre-initiation complex (PIC) op te bouwen aan de core promotor van een gen dat afgeschreven wordt door RNA-polymerase II.

🔹 Functie:

• Herkennen promotor-elementen (zoals de TATA-box).

• Rekruteren en positioneren van RNA-pol II.

• Helpen bij het openen van het DNA.

• Activeren van RNA-pol II via fosforylatie (bv. TFIIH)

🔹 Voorbeeld:
TFIID, dat bestaat uit:

• TBP (TATA-box binding protein)

• TAFs (TBP-associated factors)

🧬 2. Activator

🔹 Definitie:
Een activator is een gen-specifieke transcriptiefactor die bindt aan een enhancer of een proximale regulatorische sequentie, en zo de transcriptie van een specifiek gen verhoogt.

🔹 Functie:

• Bindt via zijn DNA-binding domein (DBD) aan een specifieke DNA-sequentie.

• Activeert transcriptie via zijn activatiedomein (AD), meestal door:

  • rekrutering van co-activatoren,

  • of door direct contact met het transcriptie-initiecomplex.

🔹 Voorbeeld:
SP1: bindt aan de GC-box in de proximale promotor van housekeeping-genen.

🧬 3. Co-activator

🔹 Definitie:
Een co-activator is een brug-eiwit dat zelf niet rechtstreeks aan DNA bindt, maar interageert met activatoren en/of de transcriptiemachinerie om transcriptie te versterken.

🔹 Functie:

• Verbindt activator met het PIC.

• Kan chromatine “openen” door:

  • histonacetylering (HAT-activiteit),

  • chromatine-remodellering (bv. SWI/SNF-complex).

🔹 Voorbeeld:
Mediator-complex: groot eiwitcomplex dat signalen van activators doorgeeft aan RNA-pol II.

🧠 Samenvattend overzicht:

Type eiwit	Bindt aan DNA?	Rol in transcriptie	Voorbeeld
Algemene TF	✅	Nodig voor basisinitiatie van transcriptie	TFIID
Activator	✅	Verhoogt transcriptie van specifieke genen	SP1
Co-activator	❌	Versterkt transcriptie via activatoren / chromatinemod.	Mediator-complex

Wat is een TATA-box Binding Protein (TBP)? Welke rol speelt het in transcriptie-initiatie en hoe beïnvloedt het de structuur van DNA?

🧬 1. Wat is TBP?

TBP = TATA-box Binding Protein, een essentieel eiwit dat een centrale rol speelt bij de start van transcriptie door RNA-polymerase II (en ook I en III).

• Maakt deel uit van het TFIID-complex, samen met 14 andere eiwitten: de TAF's (TBP-associated factors).

• Herkent en bindt aan de TATA-box, een AT-rijke sequentie in de core promotor, meestal rond -25 tot -30 bp upstream van het transcriptie startpunt.

🧬 2. Structuur van TBP

• Heeft een symmetrische PPK-structuur (pseudo-palidroom), die eruitziet als een moleculair zadel.

• Concave (holle) zijde:

  • Bestaat uit een antiparallelle β-sheet (10 AZ lang).

  • Bindt aan de minor groove van de TATA-box.

  • Zorgt voor een DNA-buiging van 80–90° ➝ dit helpt bij lokale denaturatie.

• Convexe (bolle) zijde:

  • Bevat vier α-helices.

  • Interageert met andere algemene transcriptiefactoren (TFIIA, TFIIB).

Deze buiging opent de TATA-box, waardoor het DNA toegankelijker wordt voor het verdere pre-initiation complex (PIC).

🧬 3. TFIID-complex: TBP + TAFs

• TFIID = 1 TBP + 14 TAF’s

• De TAF’s helpen bij het herkennen van andere promotor-elementen, zoals:

  • TAF1 (TAFII250): bindt aan DPE, DCE en MTE.

  • TAF2: samen met TAF1 herkent het de Inr-box.

  • TAF6 + TAF9: herkennen MTE/DPE, en werken als heterodimeer.

💡 Al deze TAF’s werken samen met activatoren, co-activatoren en chromatine-remodellerende complexen, wat de transcriptieactiviteit verder afstemt.

🧪 4. Samenvatting van de functies van TBP

Functie	Toelichting
Herkennen van TATA-box	Bindt aan de minor groove via zijn concave zijde.
Induceert DNA-buiging	Buigt DNA met 80–90°, wat smelten vergemakkelijkt.
Startpunt voor PIC-assemblage	Rekruteert achtereenvolgens TFIIA, TFIIB, RNA-pol II, enz.
Interactie met TAF’s	Helpt bij herkenning van Inr, MTE, DPE, DCE – belangrijk bij TATA-loze genen.

🎓 Modelantwoord in één zin (voor snelle herhaling)

TBP is het centrale eiwit in het TFIID-complex dat de TATA-box herkent, het DNA buigt, en de bouw van het transcriptie-initiatiecomplex mogelijk maakt door interactie met andere transcriptiefactoren en promotor-elementen.

Leg uit wat enhancers en silencers zijn. Hoe kunnen ze ondanks hun afstand tot een gen toch de genexpressie beïnvloeden?

🔵 Enhancers

• Enhancers zijn regulatoire DNA-sequenties die de transcriptie van een gen activeren, zelfs als ze zich ver van het gen bevinden (stroomopwaarts, stroomafwaarts, in introns of zelfs op andere chromosomen).

• Ze werken door de binding van transcriptionele activatoren:

  • Deze eiwitten bezitten een DNA-bindend domein (DBD) en een activatiedomein (AD).

• Door DNA-looping worden de gebonden activatoren naar de core promotor gebracht, zodat ze kunnen interageren met het transcriptie-initiecomplex.

  • Dit gebeurt vaak via architecturale eiwitten zoals het CTCF-cohesine complex (CTCF bevat 11 C2H2 Zn-vingers).

• Enhancers zijn oriëntatie-onafhankelijk en werken op grote afstand (typisch -1000 bp of meer).

• 📌 Voorbeeld:

  • CRE (cAMP response element) – bindt CREB

  • GRE (glucocorticoid response element) – bindt glucocorticoïde receptor

🔴 Silencers

• Silencers zijn DNA-elementen die transcriptie onderdrukken, meestal door het rekruteren van repressoren.

• Repressoren kunnen transcriptie remmen door:

  • Competitie met activatoren,

  • Maskeren van activatiedomeinen,

  • Rekruteren van co-repressoren zoals HDAC’s, die leiden tot deacetylatie van histonen ➝ heterochromatinevorming.

• Ze kunnen ook de openstelling van de core promotor verhinderen door het spreiden van nucleosomen.

• Silencers werken, net als enhancers, cis ten opzichte van het doelgen, maar de repressor-eiwitten worden gecodeerd in trans.

• Silencers zijn vaak weefselspecifiek actief.

🧠 Samenvattende tabel

Element	Functie	Werking	Belangrijk eiwit
Enhancer	Transcriptie activeren	Activatoren → co-activatoren → RNA-pol II activeren via looping	CREB, SP1, CTCF/cohesine
Silencer	Transcriptie remmen	Repressoren → co-repressoren → chromatine sluiten	HDAC, REST, CTCF (contextuee

Wat zijn responsieve elementen? Waarom zijn ze belangrijk voor gecoördineerde genexpressie in eukaryoten?

🧬 1. Wat zijn responsieve elementen?

Responsieve elementen (RE's) zijn korte, specifieke DNA-sequenties die fungeren als bindingsplaatsen voor transcriptiefactoren die reageren op externe of intracellulaire signalen (zoals hormonen, stress, groeifactoren, licht, enz.).

Ze liggen meestal in de proximale of distale promotorregio van een gen en vormen onderdeel van een enhancer-gebied. Elk responsief element herkent een specifieke signaal-afhankelijke transcriptiefactor.

🔗 2. Werking en voorbeeld

Wanneer een cel een signaal ontvangt (zoals een hormoon), activeert dat signaal een specifieke transcriptiefactor, die vervolgens bindt aan zijn bijbehorend responsief element op het DNA.
Dit leidt tot activering of onderdrukking van transcriptie van de doelgenen.

📌 Voorbeelden:

Responsief element	Signaal	TF die bindt
CRE (cAMP RE)	verhoogde cAMP (bv. adrenaline)	CREB
GRE (Glucocorticoid RE)	glucocorticoïde hormonen	Glucocorticoïde receptor
HSE (Heat Shock Element)	hitte, stress	HSF (heat shock factor)
ARE (Antioxidant RE)	oxidatieve stress	NRF2

🧪 3. Gecoördineerde genexpressie

Eukaryote genen die samen moeten worden gereguleerd (bv. tijdens stress of differentiatie) liggen meestal niet naast elkaar, maar verspreid over het genoom, zelfs op verschillende chromosomen.

➡ Toch kunnen ze tegelijk geactiveerd of gereprimeerd worden als ze allemaal hetzelfde responsief element bevatten.

• ➕ Dit is belangrijk bij:

  • celtype-specifieke genexpressie

  • ontwikkeling (embryogenese)

  • immuunrespons

  • metabolisme en stressreacties

🧠 Kort samengevat:

Responsieve elementen zijn specifieke DNA-sequenties waarop signaal-afhankelijke transcriptiefactoren binden. Ze maken het mogelijk dat verschillende genen — verspreid over het genoom — gelijktijdig en gecoördineerd worden gereguleerd in reactie op eenzelfde stimulus.

Wat is het verschil tussen een zinkvinger- en een leucine zipper DNA-bindingsdomein? Hoe helpen ze een transcriptiefactor om het DNA te herkennen?

🧬 1. Inleiding: DNA-bindende domeinen in transcriptiefactoren

Transcriptiefactoren (TF’s) herkennen specifieke DNA-sequenties dankzij hun DNA-bindend domein (DBD).
Twee veelvoorkomende structurele DBD’s zijn:

• het zinkvinger-motief (C2H2-type)

• het leucine zipper-motief (ook wel bZIP genoemd)

Ze zorgen ervoor dat transcriptiefactoren specifiek binden aan promotors of enhancers.

🧪 2. Zinkvinger (C2H2-type)

• Structuur:

  • Bevat 1 zink-ion (Zn²⁺) dat wordt vastgehouden door 2 cysteïnes en 2 histidines.

  • Bestaat uit een β-sheet + α-helix (gebogen door zink-ion tot “vinger”).

  • Bindt in de major groove van het DNA.

• Werking:

  • De α-helix herkent specifieke basen via waterstofbruggen.

  • Vaak meerdere vingers in tandem → verhoogde specificiteit.

• Voorbeeld:

  • SP1 bindt aan de GC-box via meerdere zinkvingers.

  • Ook veel gebruikt in genbewerking: bv. zinkvinger-nucleases (ZFNs).

🧪 3. Leucine zipper (bZIP-motief)

• Structuur:

  • Twee α-helices met elke 7 aminozuren een leucine (→ "zipper").

  • Leucines vormen een hydrofobe interface → dimerisatie.

  • N-terminaal bevat een basisch domein met lysines/arginines → DNA-binding.

• Werking:

  • Dimeer van 2 monomeren (homo- of heterodimeer) grijpt als een “tang” rond het DNA.

  • De positieve lading in het basisch domein bindt de negatief geladen DNA-ruggengraat en herkent sequenties in de major groove.

• Voorbeeld:

  • C/EBP, Jun/Fos (AP-1) zijn transcriptiefactoren met een leucine zipper.

📊 Vergelijkingstabel

Kenmerk	Zinkvinger (C2H2)	Leucine zipper (bZIP)
Structuur	Zn²⁺ + β-sheet + α-helix	Twee α-helices met leucines (7 AZ)
DNA-binding	α-helix in major groove	Dimeer bindt DNA via basisch domein
Dimeervorming	Niet noodzakelijk	Vereist voor binding (homo- of heterodimeer)
Specificiteit	Zeer specifiek via meerdere vingers	Flexibel via verschillende dimeercombinaties
Voorbeeld TF	SP1, TFIIIA	C/EBP, AP-1 (Jun/Fos)

🧠 Samenvatting in één zin

Een zinkvinger gebruikt individuele vingers met zink-coördinatie om specifieke DNA-sequenties te herkennen, terwijl een leucine zipper via dimerisatie en een basisch domein het DNA als een tang omklemt.

Wat is het belang van DNA-looping bij transcriptieregulatie? Welke eiwitten spelen hierbij een rol en hoe wordt specificiteit gegarandeerd?

🧬 1. Wat is DNA-looping?

DNA-looping is een mechanisme waarbij ver uit elkaar liggende DNA-elementen zoals enhancers of silencers fysiek in contact gebracht worden met de core promotor van een gen.
Hierdoor kunnen transcriptiefactoren die op afstand gebonden zijn toch een directe invloed uitoefenen op de transcriptie-initiatie.

🔁 2. Waarom is DNA-looping belangrijk voor transcriptieregulatie?

• Verbindt distale regulerende elementen (zoals enhancers/silencers) met promotors.

• Zorgt ervoor dat activatoren of repressoren op afstand kunnen samenwerken met het pre-initiation complex aan de promotor.

• Laat toe dat meerdere genen met dezelfde responsieve elementen gecoördineerd worden gereguleerd, zelfs als ze ver uit elkaar liggen.

• Essentieel voor:

  • Weefsel-specifieke genexpressie

  • Embryonale ontwikkeling

  • Antwoord op externe signalen (bv. stress, hormonen)

🧬 3. Welke eiwitten zijn betrokken bij DNA-looping?

De vorming en stabilisatie van DNA-lussen vereist architecturale eiwitten:

🔹 CTCF (CCCTC-binding factor)

• DNA-bindend eiwit met 11 zinkvingers (C2H2-type)

• Werkt als insulator of grensafbakening van chromatinedomeinen (TADs)

• Bindt in convergente oriëntatie aan loopgrenzen

🔹 Cohesine

• Vormt een ringstructuur rond het DNA

• “Extrudeert” DNA totdat het bij twee CTCF-sites komt, waar de lus stabiliseert

• Essentieel voor het afbakenen van topologically associated domains (TADs)

🔹 Mediator-complex

• Brug tussen activator aan de enhancer en RNA-pol II aan de promotor

• Vergemakkelijkt rekrutering van het transcriptie-initiecomplex

🔹 Linker histonen (H1) en HMG-eiwitten

• Helpen bij DNA-buiging en verpakking

🧪 4. Hoe wordt specificiteit gegarandeerd?

✔ CTCF-bindingsplaatsen zijn sequentie-specifiek, waardoor loops enkel gevormd worden tussen correcte sites.

✔ Enhancers/Silencers zijn actief binnen hun eigen TAD (Topologically Associated Domain) → beperken hun werking tot een specifiek domein.

✔ Insulators blokkeren interferentie van andere regulerende elementen buiten de lus → voorkomen verkeerde genactivatie of -repressie.

✔ Transcriptiefactoren zoals activatoren/repressoren binden alleen aan hun specifiek responsief element (bv. GRE, CRE, HSE), waardoor signaalafhankelijke regulatie mogelijk is.

🧠 Samengevat in één zin

DNA-looping brengt distale enhancers of silencers in contact met de core promotor, en wordt gecontroleerd door eiwitten zoals CTCF, cohesine en het mediator-complex, die zorgen voor precisie en domeinspecifieke transcriptieregulatie.

Wat is een insulator? Leg uit hoe het voorkomt dat enhancers of silencers ongewenste genen beïnvloeden.

🧬 1. Wat is een insulator?

Een insulator is een specifiek DNA-element dat dient als een barrière of grens tussen verschillende regulerende domeinen in het genoom.
Het voorkomt dat regulerende elementen zoals enhancers of silencers hun effect uitoefenen op niet-doelgerichte genen.

Een insulator ligt tussen:

• een enhancer/silencer en

• een promotor van een gen dat niet gereguleerd mag worden door dat element.

🚧 2. Wat doet een insulator concreet?

Er zijn twee belangrijke functies:

1. Barrier-insulator

Voorkomt dat heterochromatine zich uitbreidt naar actieve genregio’s → beschermt actieve genen tegen silencing.

2. Enhancer-blocking insulator

Blokkeert het contact tussen een enhancer/silencer en een niet-doelwitgen als het tussen beide ligt.
⟶ Het laat wel toe dat de enhancer zijn eigen target-gen bereikt via DNA-looping.

🧪 3. Hoe werkt een insulator?

Het effect van een insulator wordt niet veroorzaakt door de DNA-sequentie op zich, maar door de eiwitten die eraan binden:

🔹 CTCF (CCCTC-binding factor)

• Belangrijkste insulator-bindend eiwit bij gewervelden.

• Bevat 11 zinkvingers (C2H2-type) ➝ herkent specifieke DNA-sequenties.

• Werkt samen met cohesine om chromatine loops (TADs) af te bakenen.

Deze loops zorgen ervoor dat enhancers/silencers alleen werken binnen hun eigen domein.

🧠 4. Waarom zijn insulators belangrijk voor genregulatie?

✔ Zorgen voor precisie in genexpressie: voorkomen dat een activator of repressor per ongeluk het verkeerde gen aanstuurt.

✔ Voorkomen ruis: zonder insulators zouden enhancers van een bepaald gen ook naburige genen kunnen activeren, wat kan leiden tot abnormale expressie (bv. in kanker).

✔ Helpen bij domeinvorming: ze structureren het genoom in functionele eenheden (TADs).

📌 Kort samengevat

Een insulator is een DNA-element dat voorkomt dat een enhancer of silencer ongewenst effect heeft op andere genen. Het doet dit door grenzen te creëren tussen genregulatie-domeinen, met behulp van eiwitten zoals CTCF en cohesine.

Wat is een TATA-box Binding Protein (TBP)? Welke rol speelt het in transcriptie-initiatie en hoe beïnvloedt het de structuur van DNA?

🧬 1. Wat is TBP?

TBP staat voor TATA-box Binding Protein.
Het is een essentieel eiwit dat een centrale rol speelt bij de initiatie van transcriptie door RNA-polymerase II (en ook I en III).
TBP is het herkenningseiwit dat bindt aan de TATA-box, een conserveerde AT-rijke sequentie in de core promotor van veel eukaryote genen.

TBP is een onderdeel van het TFIID-complex, dat bestaat uit:

• TBP zelf

• TAF's (TBP-associated factors)

🧬 2. Rol van TBP in transcriptie-initiatie

✔ Stap 1 van het pre-initiation complex (PIC)
TBP is het eerste eiwit dat bindt aan de TATA-box (meestal rond -25 tot -30 bp upstream van het transcriptie startpunt).

✔ Startsignaal voor andere TF's
Na binding van TBP worden TFIIA en TFIIB gerekruteerd, wat leidt tot de opbouw van het volledige PIC en de rekrutering van RNA-polymerase II.

✔ Specifieke binding
TBP herkent en bindt aan de minor groove van de TATA-box → dit is bijzonder, want de meeste transcriptiefactoren binden in de major groove.

🧬 3. Hoe beïnvloedt TBP de DNA-structuur?

TBP veroorzaakt een lokale buiging van het DNA van ongeveer 80° tot 90°, waardoor:

• de dubbele helix lokaal wordt geopend;

• andere transcriptiefactoren gemakkelijker toegang krijgen tot het DNA;

• de initiatie van transcriptie gestimuleerd wordt.

De concave zijde van TBP bindt aan de TATA-box, terwijl de convexe zijde interageert met andere transcriptiefactoren (zoals TFIIA, TFIIB, TAF’s).

🧠 Kort samengevat:

TBP is het eiwit dat de TATA-box in de core promotor herkent en bindt. Het vormt het startpunt voor de opbouw van het transcriptie-initiatiecomplex door het DNA te buigen en andere transcriptiefactoren aan te trekken.