termen medische biotechnologie

inbreeding

zorgt voor het homozygoot worden van alle kenmerken

—> minder/geen genetische variatie

Knock-out gen

gen dat volledig is uitgeschakeld

virale vector

gemodificeerd virus dat gebruikt wordt om genetisch materiaal binnen te brengen

transgeen dier

bevat ‘vreemd’ DNA (transgen) geïncorporeerd in het genoom van alle cellen (incluis de cellen die geslachtscellen vormen). Het transgen kan doorgegeven worden aan de nakomelingen.

technieken met bevruchte oöcyt (zygote)

• zygote injectie

• nuclear transfer

• transgen ICSI

• gene targetting (recent)

technieken met embryonale stamcellen (ES-cellen)

• gene targeting

technieken met spermatogoniale cellen

• gene targeting

technieken met zaadcellen

• large scale mutagenese

• transgen ICSI

technieken met induced pluripotent stem cells (IPSCs)

• gene targeting

• overexpressie

cDNA

kopie van het mRNA met alle intronen er al uitgeknipt. Dit is korter dan het volledige gen want anders kan je het (bijna) nooit in het plasmide krijgen omdat het te groot is.

poly-A

zorgt voor de poly-A-staart die voor terminatie zorgt

YAC (yeast artificial chromosome)

• 100-1000 kb

• eventueel heel gen insteken

BAC (baterial artificial chromosome)

• tot 400kb

procedure zygote injectie

1. je geeft muis 1 de hormonen PMS & hCG die zorgen voor superovulatie

2. koppeling

3. eicellen uit de eileider verwijderen (check copulatieplug!!)

4. injectie in de pronucleus

5. terugplaatsen in een pseudo-zwangere draagmoeder (=muis 2)

• psuedo-zwangere muis:

  • gekoppeld met een gevasectomeerd mannetje

  • een muis koppelt enkel op het juiste moment in zijn 4à5 dag lange hormonale cyclus

  • copulatieplug zegt wanner we de zygote mogen implanteren

als het 2-cellige stadia bereikt is, weet je dat :

• de zygote de injectie heeft overleeft

• het bevrucht is

Founder

een ‘goede’ muis, bij inbreeding geeft die verschillende kolonies

verschillende founders hebben een ander genoom want inbreng van DNA is random

verschil transgeen en mutant dier

transgeen

= zowel het eigen als het mutant eiwit is aanwezig, er is overexpressie van het eiwit

Mutant

= normale hoeveelheid van het mutant eiwit is aanwezig, het eigen eiwit wordt niet aangemaakt

verschil chimere en mozaisce muis

chimeer

= een mengdier waarvan de cellen 2 verschillende genetische oorsprongen hebben

Mozaik

= een organisme met allemaal cellen met dezelfde genetische oorsprong waarvan een deel gemuteerd zijn en een deel niet

immunofluescente kleuring

eiwitten identificeren met een primair antilichaam. Dit AL kan dan herkent worden door een secundair antilichaam waar een fluofoor op bevestigd is.

heteroplasmie

binnen 1 cel zijn er meerdere varianten van het mitochondriaal DNA aanwezig tegelijkertijd

gene transfer

introductie van genetisch materiaal in een cel

gen therapie

introductie van genetisch materiaal in cellen (gen transfer) met als doel een ziekte te genezen

transformatie

gen transfer van DNA in een bacteriecel

transfectie

kunstmatige gen transfer van DNA in cellen

transductie

gen transfer via een virale vector

infectie

gene transfer via een virus (die aan replicatie kan doen)

plasmide

episomaal, circulair DNA in een bacterie

virus

drager om genetisch materiaal in te brengen en te repliceren (infectie)

provirus

geintegreerd viraal DNA in het gastgenoom

virale vector

drager om vreemd DNA in cellen te brengen zonder replicatie (transductie)

gene replacement

vervangen van een ziekte-oorzakende mutatie van gen met een gezonde versie

gene addition

introductie van een nieuw gen in de cellen (om tegen een ziekte vechten)

gene silencing

reduceren van het mutante gen dat niet deftig werkt (siRNA, shRNA, miRNA, … )

gene editing

KO of herschrijven van een slecht functionerend gen

in vivo delivery

rechtstreeks injecteren in het lichaam

ex vivo cell-based delivery

cellen uit het lichaam halen —> cellen modificeren —> terugplaatsen in lichaam (bv. in blood)

stabiele delivery

permanent gecorrigeerd = integratie in genoom

transient delivery

geen integratie = episomaal

de meeste cellen delen niet dus dan heeft het geen nut dat het integreert in het genoom

klinische fases

• preklinische fase

1. fase 1: is het veilig ? testen op gezonde vrijwilligers

2. fase 2: werkt de potentiële medicatie bij een kleine groep patiënten ?

3. fase 3: grote groep van patiënten met een deel placebo. Heeft het een significant voordeel?

4. fase 4: opvolging van de patiënten

R’s of animal research

• Reduction

• Refinement : reduce suffering and stress

• Replacement

functies stroma

• signaling & communication

• immune system regulation

• tissue repair and regeneration

• cancer microenvironment

• metabolic support

wnt-signaling

Stamcelidentiteit behouden

—> wnt activeert de b catetine pathway

—> stimuleert expressie van stamcelgenen

—> zorgt voor zelfvernieuwing

—> onderdrukking van differentiatie

wat zijn organoiden ?

• 3D, zelf georganiseerd

  • in vitromodellen die in vivo weefselstructuren nabootsen

• gekweekt uit stamcellen

• differentiatie in 3 kiemlagen

  • mesoderm, ectoderm, endoderm

verschillende types stamcellen

1. TDC — tissue-derived cells (uit volwassen weefsel)

2. PSC — pluripotent stamcel

   • IPSC = geïnducerde pluripotente stamcellen, typisch uit fibroblast

   • ESC = embryonale stamcellen uit blastocyst

3. CSC — cancer stem cells

rol van het Extracellulaire matrix (ECM)

het ECM omringt de epitheelcellen in alle richtingen waardoor ze in alle dimensies groeien (3D)

• structurele ondersteuning

• integrines (=ECM receptor) op ephitheelcellen binden aan de ECM-eiwitten waardoor het epitheel verankerd is aan het ECM

• groeifactoren

  • wnt: stamcelonderhoud

  • EGF: bevordert prolferatie

• polarisatie van het epitheel

  • apicale zijde richting lumen

  • basale zijde richting ECM

• matrixstijfheid en samenstelling om de ruimtelijke differentiatie te sturen

  • zacht = meer differentiatie

  • stijf = meer proliferatie & migratie

FGF

zorgt dat cellen blijven delen

—> ondersteunt proliferatie

—> bevordert morfogenese en organisatie

—> belangrijk voor differentiatie

HGF - hepatocyte growth factor

—> stimuleert celoverleving, proliferatie en migratie

—> beschermt stamcellen tegen apoptose en helpt bij weefselherstel

IGF - insulin-like growth factor

—> bevordert groei en overleven van cellen

—> activeert anti-apoptotische signalen

ROCK-inhibitoren (rho associated kinase inhibitors)

—> voorkomen apoptose

—> de overlevingskans tijdens kweek

BMP-remmers

—> voorkomen differentiatie

TGF-b-remmers

—> verhindert dat epitheliale cellen EMT (epithelial-to-mesechymal transition) ondergaan

Flow (shear stress)

= sterk regelbare laminaire stroom

• microfluidische kanalen

• continue perfusie mbv pompen

—> endotheelcellen oriënteren zich in stroomrichting

—> nabootsen bloedcirculatie

—> beinvloedt genexpressie en functie

Het geeft een meer realistisch en physiologisch model

mechanische strectch / compressie

met flexibel membraan en vacuüm kamers

—> stimulatie van bewegingen (bv. ademhaling long)

—> beweging van cellen beïnvloedt hun gedrag

stijfheid van de matrix

= hydrogels met regelbare stijfheid en verschillende biomaterialen

—> het heeft invloed op de cel functie

—> specifiek op cel differentiatie, proliferatie & migratie

zacht = hersenachtig

stijf = botachtig

Repeats (CRISPR)

• 30bp

• zelfde sequentie

• palindromic

• vormen de stem-loop of hairpin wanneer ze naar RNA worden getransleerd

Spacers (CRISPR)

• kleine segmenten van faag DNA

• hebben elk een andere sequentie = molecular memories

cas proteins

• capture fragments of phage DNA

• measure and cut a precisely sized piece of DNA

PAM (protospacer adjacent motive)

herkenningsequentie voor het binden van het cas-eiwit om er op te binden en te knippen

niet aanwezig op de spacers = veiligheid om niet eigen DNA te knippen

recognition lobe (REC) in cas9

carries guide RNA

nuclease lobe (NUC)

2 blades om de 2 strands te knippen

werking cas9 (4 stappen)

1. PAM herkening

2. Base-pairing

3. complete binding

4. DAN target cleavage

Base-editing

= voor precise editing van single nucleotides

purine —> purine & pyrimidine —> pyrimidine

benodigheden:

• gRNA

• nCas9 (=nicase)

• deaminase

+ handig voor puntmutaties

+ geen double-stranded break = minder riskant

- gelimiteerde mogelijkheden

- ongewenste off-target editing

Prime-editing

= voor puntmutaties (pyrimidine ←→ purine)

benodigdheden:

• pegRNA

  • spacer

  • scaffold

  • RT template

  • PBS = primer binding site

• nCas9

• reverse transcriptase (RT)

NOG INVULLLEN !!!!

CRISPRa

activation

CRISPRi

interference