Mikrobiologia wejściówka 2

Błędy przedlaboratyjne w diagnostyce

32-75%

• pobranie próbki krwi na niewłaściwy koagulant

• nieprawidłowa identyfikacja pacjenta

• nieprawidłowy transport próbki

• niedostateczna ilość materiału biologicznego w próbce

Zasady pobierania materiału

• odpowiednie przygotowania pacjenta

• aseptycznie, do jałowego pojemnika

• z miejsca zmienionego chorobowo

• świeże materiały

• przed rozpoczęciem antybiotykoterapii

• ok. 30 minut przed szczytem gorączki (największe stężenie bakterii w krwi obwodowej)

Dane na skierowaniu do pobierania materiału klinicznego

• nazwa materiału

• data i godzina pobrania

• dane pacjenta

• oddział, dane lekarza prowadzącego

• rozpoznanie kliniczne

• ewentualnie kierunek diagnostyki

Opis próbki materiału klinicznego - dane

• nazwa materiału

• data i godzina pobrania

• dane pacjenta

Ile moczu do pojemnika z podłożem hodowlanym

ok. 3 ml

ile kału do badań

2 ml, próbka wielkości ziarna grochu

Zasady transportu materiałów klinicznych

• jałowy transport w dezynfekowalnym kontenerach

• dostarczenie jak najszybciej do laboratorium (15 minut-24 h)

• odpowiednia temperatura 4-37 C

cele - materiały w zapaleniu gardła i/lub migdałków

1 cel - różnicowanie zakażenia wirusowego od zakażenia bakteryjnego

• najczęściej Streptococcus pyogenes

2 cel - wykrycie nosicielstwa drobnoustrojów chorobotwórczych w gardle

Nosicielstwo definicja i podział

stała lub przejściowa obecność drobnoustrojów chorobotwórczych w organizmie człowieka, brak objawów zakażenia

• stałe (dur brzuszny)

• tymczasowe - ozdrowieńcy (3 miesiące od przebycia choroby)

Nosicielstwo S. aureus

przedsionek nosa, gardło

Nosicielstwo S. pneumoniae

jama nosowo-gardłowa

Nosicielstwo Enterococcus

okolice odbytu

Nosicielstwo N. meningtidis

nos, gardło

Nosicielstwo Haemophilus

górne drogi oddechowe

Cele pobierania materiałów w zakażeniach nosa

1 - określenie nosicielstwa szczepów S. aureus (20-30%). Znaczenie epidemioologiczne ma nosiciestwo MRSA lub N. meningtidis

2 - diagnostyka zakażenia o etiologii Klebsiella (cuchnący nieżyt nosa, twardziel)

Wymaz z jamy nosowo-gardłowej podejrzenia zakażenia + sposób pobrania

N. meningtidis - meningokok

Bordetella pertussis - krztusiec (śluz z tylnej ściany jamy gardła na wymazówkę z dakronu lub aliginianu wapnia)

wirusy RVS, grypa, SARS-CoV-2 (wymaz z tylnej ściany gardła i obu nozdzry)

Wyma z jamy nosowo-gardłowej procedura

• wymaz można pobrać przez nos lub jamę ustną

• należy użyc wymazówki o cienkim elastycznym trzonku

Punktat z zatok procedura

materiał pobrany podczas endoskopii przenieść do jałowego pojemnika

Pobieranie materiału z ucha środkowego procedura

• materiał należy pobrać po oczyszczeniu i zdezynfekowaniu kanału zewnętrznego ucha

• aspirat poprzez nakłucie błony bębenkowej

• wydzielinę ropną przy pękniętej błonie bębenkowej pobrać na wymazówkę z podłożem transportowym

Pobieranie materiałów z zakażeniach dolnych dróg oddech.

• materiał pobierany w sposób nieinwazyjny - plwocina

• materiały pobierane przy użyciu metod inwazyjnych

  • bronchoskopia - popłuczyny pęcherzykowo-oskrzelowe BAL, biopsje szczoteczkowe

  • nakłucie tchawicy pomiędzy chrząstką pierścieniową a tarczową - aspiraty śródtchawicze

  • w czasie odsysania wydzieliny przy użyciu cewnika wprowadzonego przez rurkę tracheostomijną - aspiraty tchawicze

Ocena przydatności próbki plwociny do badania

barwienie metodą Grama

materiał diagnostyczny - >25 leukocytów i <10 komórek nabłonkowych (plwocina, w innym przypadku ślina)

Pobór plwociny zasady

• materiał należy pobrać rano

• ułatwienie odkrztuszania - oklepanie pacjenta, podanie leku mukolitycznego, inhalacja 10% roztworem NaCl

• przed oddaniem plwociny należy:

  • usunąć protezy zębowe, ruchome aparaty ortodontyzne

  • dokładnie wypłukać jamę ustną przegotowaną wodą

• próbkę należy pobrać do jałowego pojemnika w ilości co najmniej 2 ml

pobieranie materiałow z zakażenia oka

• nie należy wykonywać posiewów w ciągu 4 godzin od ostatniego podania do oka kropli dezynfekcyjnych, chemioterapeutyków lub środków znieczulających

• skąpy materiał do badań

• wymazy ze spojówek - wymazówki z alginianu wapnia lub dakronu

Pobieranie ropy z ran procedura

• okolicę rany odkazić 70% alkoholem, pozostawić do wyschnięcia

• pobrać wymaz wymazówką zwilżoną solą fizjologiczną do jałowej probówki i/lub podłoża transportowego

Pobieranie materiału ze zmian powierzchownych na skórze

ruchem obrotowym materiał z dna rany

Pobieranie materiału ze zmian głebokich skóry

pobrać strzykawką ok. 1 ml

przechowywanie i transport: 20-22 C do 2h

Pobieranie moczu w zakażeniu dróg moczowych zasady

• mocz pobieramy ze środkowego strumienia z porannej porcji do jałowego pojemnika, po dokładnym umyciu okolic intymnych pacjenta

• u kobiet 2 dni przed lub po menstruacji

• mocz w jałowym pojemniku dostarczyć do 2h w temperaturze pokojowej lub przechowywać w temp. 4C do 4h

• mocz na podłożu transportowo-namnażającym (Uromedium) - w temp. pokojowej lub do czasu transportu 37 C

• mocz z cewnika ma niską wartość diagnostyczną

pobieranie krwi system

• odpowiedni skład podłoża do wzrostu bakterii tlenowych (Aerobic) i beztlenowych (Anaerobic)

• do wzrostu grzybów

• podłoża pediatryczne dla dzieci o zmniejszonej ilości składników odżywczych

• dodatkowo komplet 2 butelek do wzrostu bakterii tlenowych i beztlenowych dla pacjentó w trakcie antybiotykoterapii

pobranie krwi z cewnika naczyniowego cel

tylko potwierdzenie zakażenia odcewnikowego (duża możliwość tworzenia biofilmu na powierzchniach sztucznych – cewniki obwodowe i centralne i transmisji do krwi)

krew z cewnika naczyniowego - metody

posiew metodą Maki ( półilościowy – umożliwiający wykrycie kolonizacji na zewnętrznej powierzchni cewnika)

posiew metodą Brun – Bruisson ( ilościowy – umożliwiający wykrycie bakterii na powierzchni lub w świetle cewnika)

Pobieranie krwi w ostrym przebiegu infekcji z gorączką

dwukrotnie z 2 odrębnych wkłuć

pobranie krwi przy gorączce o nieznanej etiologii

2 próbki w odstępach godzinnych, powtórzyć po 24 i 48 h

Pobranie krwi w endocarditis

2-3 próbki w ciągu doby

Pobranie krwi w przypadku braku wzrostu drobnoustrojów

powtórzyć przy każdym epizodzie gorączki w ciągu 2 dni

objętość próbek na pobranie krwi

dla dorosłych 10-20 ml

dla dzieci 2,5-10 ml

Rodzaje badań kału

• w kierunku nosicielstwa pałeczek z rodziny Enterobacteriacae ESBL (+)

• badanie w kierunku Clostridioides difficile

• badanie w kierunku nosicielstwa:

  • Enterococcus faecium

  • Enterococcus faecalis oporne na wankomycynę - VRE

• badanie w kierunku nosicielstwa Staphylococcus aureus MRSA

• badanie w kierunku zakażenia o etiologii grzybiczej

• badania wirusologiczne

wirusy biegunkowe

• Rotawirus

• Adenowirus

• Norowirus

• Astrowirus

Pobranie płynu mózgowo-rdzeniowego zasady

• dezynfekcja skóry przed wkłuciem

• nakłucie lędżwiowe ok. 1-2 ml

• badania bakteriologiczne - transport w ciągu 15 minut w 37 C

• badania wirusologiczne - 2-8 C lub zamrożenie próbki

Tok diagnostyczny

• pobranie materiału do badań

• morfologia makro i mikroskopowa

• hodowla i identyfikacja gatunkowa - posiew

• cechy fizjologiczne i biochemiczne

• wrażliwość na antybiotyki

• serologia biologia molekularna

Podłoża i pożywki podział

• stan skupienia

  • stałe - agar 1,5-2% (algi, żelatyna)

  • płynne - bulion, wyciąg mięsny, pepton, NaCl

• składniki odżywcze

  • minimalne

  • wzbogacone - dodatki np. krew, surowica, cukry proste

• pochodzenie

  • naturalne - wyciąg mleka, mięsa, jaj, krwi, surowicy, ziemniaka

  • syntetyczne

Proces przygotowania podłży

• naważenie

• rozpuszczenie w wodzie destylyzowanej

• autoklawowanie

• wylewanie podłoża

Warunki hodowlii bakterii tlenowych

18-24 h inkubacji, 35 ± 2C

Warunki hodowli bakterii beztlenowych

• podłoże stałe agar Scheadlera z krwią

• hodowle kłute w słupkach

• Gas-Pak z bromowodorkiem sodu (powstaje wodór) lub dwuwęglanem sodu (powstaje CO2)

• odczynniki z hodowlą bakterii umieszcza się w słojach, torebkach, systemach próżniowych

Podział bakterii ze względu na zapotrzebowania pokarmowe

• autotrofy - źródłem węgla CO2

  • fotoautotrofy - energia z fotosyntezy

  • chemolitoautotrofy - energia z redukowania związków nieorganicznych

• heterotrofy - wymagają obecności substancji organicznych

  • prototrofy - źródłem węgla jeden związek

  • auksotrofy - wymagają większej ilości substancji organicznych

Podział bakterii ze względu na zapotrzebowanie na tlen

• bezwzględnie tlenowce

• mikroaerofile - rosną najlepiej przy zwiększonym stężeniu dwutlenku węgla i obniżonym stężeniu tlenu

• względnie beztlenowce - mogą rosnąć w obu wypadkach

• aerotolerancyjne - przez krótki okres czasu mogą przeżyć w obecności tlenu, przy dłuższej ekspozycji giną

• bezwzględnie beztlenowce - giną przy ciśnieniu tlenu 10^-5 atmosfery

Podział bakterii ze względu na optymalną temperaturę wzrostu

• psychrofile – optymalny wzrost w zakresie temperatur 0 -10 °C (Yersina enterocolitica)

• mezofile - optymalny wzrost w zakresie temperatur 20 - 40 °C

• termofile - optymalny wzrost w zakresie temperatur 50 - 60 °C

• Hypertemofile – > 80 °C

podział wzrostu

• bulion zwykły

• wzrost dyfuzyjny - zmętnienie podłoża (pałeczki, względne beztlenowce)

• wzrost powierzchowny - Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis

  • bezwzględne beztlenowce i mikroareofile

• osad - Pseudomonas aeruginosa

  • paciorkowce, względne i bezwzględne beztlenowce

opis morfologii kolonii

• wielkość

• typ wzrostu (powierzchowny, wgłębny)

• kształt (okrągła, rozgałęziona, pofałdowana, nieregularna)

• powierzchnia (gładka, pomarszczona, matowa, lśniąca, pofałdowana, krzaczkowata)

• brzeg (falisty, pomarszczony, ząbkowany, rozgałęziony, nitkowaty, gładki)

• szczyt (płaski, wzniesiony, wypukły)

• przejrzystość (przejrzysta, półprzejrzysta, nieprzejrzysta, opalizująca)

• konsystencja (masłowata, miękka, twarda, krusząca, kremowa, ciągnąca)

• barwa i barwnik dyfundujący do podłoża

Podłoże MacConkeya

• dla pałeczek jelitowych Gram ujemnych

• czynniki wybiórcze: fiolet krystaliczny i sól kw. żółciowych – dezoksycholan sodu – hamowanie wzrostu ziarenkowców

• czynnik różnicujący: laktoza, laktozo + (różowe, różowa strefa wytrąconych soli żółciowych) i laktozo – (bezbarwne)

• Czerwień obojętna – wskaźnik zmiany pH

Podłoża wybiórczo-różnicujące

• Wybiórcze - z dodatkiem substancji, które umożliwiają wzrost tylko pewnym określonym gatunkom bakterii lub grzybów, jednocześnie hamują wzrost innych gatunków

• Różnicujące - z dodatkiem substancji, które umożliwiają wzrost kilku lub kilkunastu gatunków, ale każdy z nich wytwarza charakterystyczne kolonie

• Wybiórczo-różnicujące np. MacConkeya, Chapmana

Podłoże MacConkeya - laktozododatnie

• Escherichia coli

• Klebsiella pneumoniae

• Enterobacter

Podłoże MacConkeya - laktozoujemne

• Proteus

• Salmonella

• Shigella

• Yersinia

• Pseudomonas

• Acinetobacter

podłoże Chapmana

dla gronkowców Gram+

• czynnik wybiórczy: wysokie stężenie NaCl 7,5-10% (hamuje Gram-ujemne)

• czynnik różnicujący: rozkład mannitolu (zakwaszenie)

• wskaźnik pH - czerwień fenolowa, zmiana barwy z czerwonej na żółtą

Podłoże Chapmana mannitolo+

Staphylococcus aureus

Podłoże Chapmana mannitolo -

Staphylococcus epidermidis

podłoża wzbogacone

Podłoże krwawe: agar odżywczy + 5-10% erytrocytów z krwi owczej

• β-hemolizujące – całkowita hemoliza otoczenia: Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus

• α-hemolizujące – nie całkowita hemoliza i zmiana zabarwienia wokół kolonii: Streptococcus pneumoniae, paciorkowce zieleniące

• γ-hemoliza – brak hemolizy: Enterococcus

Testy MALDI

MALDI-TOF MS - identyfikacja gatunkowa w oparciu o unikalny profil białkowy (odcisk palca)

• szybkie, nowoczesne i ekonomiczne metody oparte o spektrometrię mas

• niezwłoczna i prawidłowa identyfikacja

• wczesne wdrożenie skutecznej terapii

• Identyfikacja wielolekoopornych szczepów bakterii