5.Klonowanie DNA

Rekombinacja to …

zdolność do wymiany odcinków DNA przez pękanie i łączenie łańcuchów nukletoydów

Rekombinacja może być: …

homologiczna

konwersją

rekombinacją

transpozycją

-homologiczna (między frag. DNA o homologii między 2 cz. W obrębie 1) (naprawa pęknięć nici replikacyjnej, odblokowywanie widełek, crossing over)

-konwersja (przekształcenie 1 allelu w drugi przez naprawę uszkodzonego DNA) (auto lub tarns-chromosomowo)

-rekombinacja (integracja genów) (regulowana przez E w cz. O krótkim obszarze homologicznym)

-transpozycja (rekombinacja między niespokrewnionymi sekwencjami) (wymaga E transpozaz)

Transpozycja jest zmianą nieuprawnioną mogącą prowadzić do mutacji (np. między niehomologicznymi chromosomami)

Mechanizm klonowania faga gamma: … (4)

-liniowe DNA faga tworzy koło poprzez połaczenie miejsc cos

-DNA faga łączy się z plazmidem przez regiony Att

-rekombinacja

-ekspresja genu=replikacja faga

E restrykcyjne są używane przez bakterie jako …

ochrona przed obcym DNA

Działanie RE-azy: …

tnięcie fagowych DNA na kawałki i degradacja

Działanie MT-azy (metylo-transferazy): …

metylacja nukleotydów własnego DNA, amplifikując lub wyciszając je

Klon to …

grupa kom. z jednakowymi cz. zrekombinowanego DNA

Nukleazy to …

E tnące wiązania fosfodiestrowe w kw. nukleinowych

Nukleaza S1 działa na … i …

DNA-za I działa na … i …

ssDNA, RNA (do mapowania transkryptów)

dsDNA, RNA (do analizy śladów)

Użytek nukleazy S1:

-analiza hybryd D/RNA

-lepkie>tępe końce

-otwieranie hairpinów

Ciecie DNA-zą I daje …

polinukleotyd z PO4 3- na 5` i -OH na 3`

DNAza I bierze udział w procesie …

apoptozy

Dronaza alfa to …

genetycznie modyfikowana DNAza I (terapia mukowiscydozy)

Endonukleazy restrykcyjne działają tylko na …

dsDNA

Typy E restrykcyjnych

Izoschizomery to …

E restrykcyjne różnych bakterii tnące te same sekwencje w ten sam sposób

Mapa restrykcyjna to …

graficzny sposób przedstawienia wyników cięcia DNA przez różne E restrykcyjne z uwzględnieniem odległości między nimi

Pol TDT to ...

polimeraza niewymagająca matryc

Polimeraza TDT syntezuje …

homopolimerowe ogony (np. GGGGGGGGGGGGGG)

Szczególnie aktywna w nowotworach

Do swojej funkcji ligazy Prokaryota używają …

Do swojej funkcji ligazy Eukaryota używają …

NAD+

ATP

Najczęściej wykorzystywaną ligazą jest …

ligaza T4

Do E modyfikujacych końce należą: …

ALP

Kinaza polinukleotydowa T4

Pol TDT4

ALP-usuwa PO4 3- z 5` i hydrolizuje wiązanie fosfodiestrowe

Kinaza polinukleotydowa T4-transfer PO4 3- z ATP na 5` DNA i RNA, gdy tam nie ma

Polimeraza TDT-ligacja -OH na 3` na lepkich końcach ss- i dsDNA

Topoizomerazy odpowiadają za … i …

stopień skręcenia helisy

rozplatają je

Topoizomeraza I rozcina … nić DNA i … (funkcja)

1

usuwa skręty w DNA (relaksacja)

Topoizomeraza II (gyraza) rozcina … nici DNA i … (funkcja)

2, łączy je wiązaniem fosfodiestrowym (mocniejsze skręcanie)

Topoizomerazy klasy A łączą się z …

Topoizomerazy klasy B łaczą się z …

PO4 3- na 5`

3`

Metylazy odpowiadają za …

metylację DNA

Funkcja Dam: …

przenosi -CH3 z SAM do A w 6 pozycji 5`-GATC-3`

Funkcja Dcm: …

metyluje wew. C w sekwencji 5`-CC(A/T)GG-3`

Przed ligacją bakterie:

-inkubuje się w 4*C z Ca2+, potem szybko w 37-42*C

-elektroporuje

Cechy wektora plazmidowego: … (3)

-niezdolny do przeżycia poza kom.

-łatwo izolowalny z kom.

-nie powinny mieć genów grożących ekologicznie

Wektor powinien zaweirać: …

ori

MCS

geny markerowe (oporności na lek) (amp, tel)

gen beta-laktamazy

gen lacZ

gen letalny (hamuje wzrost rekombinantów)

Bakteriofag, fag to …

wirus infekujący bakterie przez transdukcję

PAC-sztuczny chromosom wyprowadzany z faha P1

BAC-sztuczny chromosom bakteryjny

YAC-sztuczny chromosom drożdżowy

MAC-sztuczny chromosom ssaczy

HAC-sztuczny chromosom ludzki

Wektory ekspresyjne to …

wektory pozwalające na ekspresję wstawionego DNA

Żeby móc otrzymywać białka Eukaryota z wektorów bakteryjnych u bakterii, muszą posiadać …

sekwencję promotorową

Aby mogła zajść translacja genu mRNA, sekwencje muszą mieć … (3)

Shine-Dalgarno (ATG)

Terminator transkrypcji

Do wizualizacji rekombinowanych białek używa się …

lucyferazy (reporter luc)