tenta 26/10 inledande bioteknik

Vilka uppgifter har proteiner i cellen? Ge 3 exempel.

Vilka uppgifter har proteiner i cellen? Ge 3 exempel.

Katalysera processer, mekaniskt stöd, immunproteiner

Rita upp den kemiska strukturen för en valfri aminosyra. Vilka substituenter finns på alfakolet? Vilken substitutent är ”sidokedjan”?

rita och googla

Hur många olika aminosyror bygger cellen upp proteiner av?

20

 Aminosyrorna kan delas in i ett antal grupper beroende på sidokedjan. Namnge grupperna.

Hydrofobiska aminosyror, polära oladdade aminosyror(hydrofila), positivt laddade aminosyror, negativt laddade aminosyror

 Ge exempel på aminosyra med minusladdad sidokedja (vid pH 7)

aspartat

Ge exempel på aminosyra med plusladdad sidokedja (vid pH 7)

Lysin

Ge exempel på aminosyra med OH

serin

Ge exempel på aminosyra med SH-grupp

cysteine

Hur ser en dipeptid ut (rita upp den principiella strukturen)

Är alla bindningarna i en dipeptid flexibla?

Nej det är inte, för att det uppstår steriska hinder, och det finns vinklar som inte är förekommande.

Definiera psi och phi?

Phi är vinkeln av rotationen mellan kväve och alfakolet, psi är vinkeln av rotationen mellan karbonylatomerna och alfakolet.

Vad menas med en oligopeptid och en polypeptid?

Oligopeptid 2-50 aminosyror, poplypeptid är allmänt begrepp för aminosyror som sitter ihop.

Vad är aminoterminal och karboxylterminal i en polypeptid.

NH2 änden av polypeptiden, en amingrupp. Karboxylgruppen består av ett kol som dubbelbinden till ett syre och en OH grupp.

 Från vilket håll räknar man aminosyrorna i en polypeptid?

Man börjar från aminogruppen till vänster

Hur får man disulfidbryggor (-S-S-) i ett protein – vilka aminosyror deltar?

När cystein binder till en annan cystein. Endast cystein. kovalentbindning

Vad menas med primärstruktur, sekundärstruktur och tertiärstruktur?

Primärstruktur är ordningen av aminosyrorna i ett protein, sekundärstruktur är bildandet av alfahelixar, omega loop, reverse turn och beta sheets som beror på vätebindningar och disulfidbindningar i princip alltid samma kedja (regular pattern of hydrogen bonds. Teritiärstruktur, hur sekundärstrukturerna lägger sig i förhållande till varandra, de hydrofoba aminosyrorna placeras på insidan och hydrofila uttått. Det leder till att globulära eller fiborösa proteiner bildas. I globulära proteiner läggs de hydrofoba delarna innåt och de hydrofila utått. Samma i fiborösa men de har inte den formation som gör att proteinet kan tryckas ihop.

En polypeptidkedja kan tack vare sin blandning av stela och flexibla element vecka sig i regelbundna/typiska veckningselement (sekundärstrukturer). Vilka?

alfahelix, betastruktur, beta-turn, och omega-loop

Ge några karakteristiska drag för: alfahelix, betastruktur, beta-turn, och omega-loop.

Alfa helix är en spiral som bildas av att vätebindningar bildas mellan 1:a kolets karboxylgrupp och 4:e aminogruppen.

 

I en betastruktur lägger sig aminosyrakedjan ovanpå sig själv. Detta kan ske både parallellt eller antiparallellt . Syret binder till vätet i aminogruppen. I parallell kol 1 till amino 3. i antiparallell kol 1 till kol 1.

 

Betaturn, är en hairpin det vill säga en u-sväng görs. Den viker sig dubbelt och binder där uppe i toppen. Vätebindningar mellan kol 1 och 3.

 

Omgega turn: intramolukulära bindningar som inte kan klassificeras som de övre den har inte speciella regler som de ovan. Inga regelbundna bindningsmönster.

Hur skiljer sig vätebindningarna radikalt i alfahelix och i betastruktur?

I alfahelixstruktur skapad vätebindningar parallellt inom strukturen mellan närliggande kol. Alfa alltid 1: till 4:e. Medan det i en beta struktur är mellan olika delar av kedjan.

Vad menas med parallell och antiparallell betastruktur?

Om de går i samma riktning eller inte.

Vilka likheter och skillnader finns mellan beta-turn och omega-loop?

Skillnad beta-turn är alltid regelbunden form vätebindning mellan kol 1 och 3, men omgega loops är oregelbundna, likheter de återvänder kedjan och uppstår genom vätebindningar

 Hur ser a-keratin ut?

Det ser ut som en spiral. En grupp av protiener som bildar en superhelix, två helixar skapar en superhelix dvs två helixar gör en helix.

Vad innebär det att ett protein veckas? Förklara vad som menas med random coil? Denaturerat protein? Nativt protein?

Det betyder att de aminosyrorna veckar sig i den form som ger lägst "lägesenergi". Genom vätebindningar, disulfidbryggor och hydrofil/hydrofob väckning sänks denna energi. Om väckningen går fel bildas ett random coil/scrambled protein. Det är ett stadie som sänker energin men inte lika mycket som nativestadiet. Om det blir fel hjälper ofta chaperoner att höja energin igen så nativestadiet kan nås. Fel protein foldning gör antigen att funktionaliteten sänks eller försvinner helt. Ett denaturerat protein är ett protein som inte är foldat.

När ett protein veckar sig hamnar de allra flesta polära aminosyror (hydrofila) på ytan medan de oplära (hydrofoba) i stor utsträckning finns i proteiners inre. Varför är det så?

Polära aminosyror (hydrofila) tenderar att vara på proteiners yta på grund av deras förmåga att bilda vätebindningar med vattenmolekyler. Detta beror på de laddade eller polära grupper som finns i deras sidokedjor, vilka interagerar väl med vatten. Opolära aminosyror (hydrofoba) finns i stor utsträckning i proteiners inre eftersom de inte interagerar väl med vatten på grund av deras icke-polära sidokedjor. De tenderar att "gömma sig" i proteinets inre för att undvika kontakt med vatten och för att upprätthålla proteinets stabilitet. Denna uppdelning hjälper till att optimera proteinets struktur och funktion genom att placera de olika aminosyrorna där de bäst kan interagera med sina omgivningar och upprätthålla proteinets stabilitet.

Vad är en subenhet? Hur många subenhet finns i en tetramer?

En polypeptidkedja eller proteinmolekyl som med andra bildar ett proteinkomplex.

Hur kan en enzym-assay användas för att beräkna den specifika aktiviteten under en proteinupprening (förutsatt att det upprenade proteinet är ett enzym)?

Den kan användas genom att en produkt av enzymaktivitet kan detekteras i t.ex. spektrofotometer. Då kan en linjärregression upprättas och en indirekt mättning av enzymaktivitet kan genomföras. Desto mer av produkten desto mer enzymaktivitet

Hur kan centrifugering användas för att få fram olika fraktioner från ett cell-homogenat?

Man kan centrifugera i olika omgångar för att få fram olika tunga proteiner.

Vilka skillnader och likheter finns mellan jonbytes-kromatografi (ion-exchange chromatography) och affinitetskromatografi (affinity chromatography).

laddningen för ett protein vid ett visst pH värde beror på R-grupperna. Vid jonbyteskromatografi är kolonnen fylld med en massa som antingen är positiv eller negativ. Om man vill rena fram ett positivt protein i ett visst pH fylls kolonnen med negativa joner vilket gör att övriga proteiner med negativ laddning rinner igenom med elueringsvätskan som hälls bort. kvar blir de önskade proteinerna som sedan släpps genom att positivt laddade joner “knuffar” bort proteinmolekylerna och konkurerrar ut dem när det gäller bindningen till kolonnens negativt laddade grupper. Vissa proteiner binder starkt till specifika molekyler. Dessa molekyler kallas i affinitetskromatografi för ligander. Genom att fästa en ligand (kan vara antikropp) till bärarmaterialet kan ett visst protein fastna under elueringsprocessen samtidigt som andra proteiner passerar med elueringsvätskan. En elueringsvätska med speciellt pH-värde eller salthalt kan få proteinet att släppa från liganden. De har alltså gemensamt att proteinet binder till något som sitter på insidan av kolonnen och att man låter en elueringsvätska rinna igenom.

Vad är skillnad mellan kation-bytes och anion-bytes kromatografi?'

I kations-bytes kromatografi använder man negativa joner för att separera positiva joner meddans aninon-bytes kromatografi använder positiva joner för att separera ut negativa joner

 Beskriv principen för elektrofores och hur det kan användas för att separera proteiner.

Principen är att molekyler med laddning förflyttas genom en gel med hjälp av det elektriska fältet. De större molekylerna utsätts för steriska hinder i större grad än mindre vilket gör att de mindre molekylerna kan röra sig snabbare.

Vad står förkortningen SDS-PAGE för

polyakrylamidgelelektrofores

Varför tillsätts SDS (sodium dodecyl sulfat) vid polyacrylamide gel-elektrofores (PAGE)? (svaret är på engelska tihi)

Sodium dodecyl is added because it disrupts the noncovalent interactions in a native protein. The negative charge is thus increased, this process is proportional to the mass of the protein one anion of SDS molecule binds to two aminoacid residues.

Förklara vad begreppet isoelektrisk punkt (pI) betyder och hur s k isoelektrisk fokusering kan användas för att separera proteiner. (svarade på eng)

The isoelectric point(pI) of a protein is the pH where the net charge is zero. The electrophorectic mobility is zero. (the aminoacid is in the non-charged form NH2 and COOH). In isoelectric focussing this mechanism is used in the sense that a protein mixture undergoes electrophoreisis without SDS, each protein will move until it reaches a position in the gel that has the same pH as the pI of the protein.

Förklara begreppen antikropp, antigen, epitop och immunoglobulin (Ig) (eng)

A antibody is a immunoglobolin aka a protein which is a Y-shaped protein which is made by special cells called B-cells. They both detect and neutralise foregin substances.

A antigen is a foreign substance

A epitop is particular structure or feture of a antigen.

Vad är skillnaden mellan monoklonala och polyklonale antikroppar? (eng)

Monoklonal antibodies are antibodies which are made by the same B-lymfocyte which means that they are exact clones of eachother.

Polyklonale antibodies are antibodies which are made from diffrent B-lymfocytes but target the same antigen. Diffrent epitops are recognized.

Beskriv kortfattat hur antikroppar kan användas för att analysera mängden av ett protein.

Genom ELIZA (enzyme linked immunosorbent assay) coatas först botten med antigen, till dessa binder antikroppar vilka i sin tur enzymlänkade anitkroppar binder. När substratet binder omvandlas detta till en färgad produkt. Tempot av detta beror på koncentrationen av proteiner som vill mätas det vill säga antigen.

Även vid affiniteteskromatografi utnyttjar antikroppar.

Vad är indirekt och sandwich-ELISA? Vad mätar de?

Genom ELIZA (enzyme linked immunosorbent assay) coatas först botten med antigen, till dessa binder antikroppar vilka i sin tur enzymlänkade anitkroppar binder. När substratet binder omvandlas detta till en färgad produkt. Tempot av detta beror på koncentrationen av proteiner som vill mätas det vill säga antigen.

Vad är sandwich-ELISA? Vad mätar de?

Sandwich-ELIZA är monoklonala antikroppar coatar botten och antigen binder till dessa och därefter en andra monoklonal antikropp binder till dessa. Substrat tillsätts sedan som gör att en färg bildas som kan indikera mängden protein.

 Varför heter det adaptivt immunsvar?

För att det anpassar sig efter vilka behov cellerna har. Det vill säga det är specifikt men fördröjt, det skapar specifika antikroppar och T-celler för det infekterande patogenet. Skapar även immunitet genom minnesceller.

Hur skapas antikroppsvariabiliteten (hur kan vi ha så stort antal olika B-cellskloner?)

Det skapas då vi har 10^14 olika B-celler, som alla bär en unik antikroppsmolekyl. Antikroppsgener består av olika gensekvenser som kan rekomineras på många olika sätt.

Vilka typer av celler kan en B-cell differentiera till efter aktivering? Vad har de för funktion?

Minnesceller, mycket långlivade celler som aktiveras när samma antigen kopplas. Plasmaceller, producerar stora mängder av antigensspecifika antikroppar.

Varför tar det flera dagar innan vi har fått ett effektivt adaptivt immunsvar (germinalcenterreaktionen)?

Först aktiveras B-cellerna om de lyckas binda till ett antigen. Därefter bildas ett germinalcenter i lymfkörtlarna.   De skiljer ut sig från de andra och utsätts för punktmutationer i antikroppsgenerna. På det sättet skapas antikroppar som binder starkare till antigenet. Antikropparna blir bättre ju längre infektionen går.

Vad är skillnaden på exogena och endogena antigen? Vad finns det för exempel där antikroppar kan bildas mot kroppsegna antigen?

Exogena är främmande substanser t.ex. virus, bakterier, parasiter, svampar. Endogena kroppseget antigen markerar för kroppen att de är ofarliga. Ms.

Vad är den huvudsakliga skillnaden mellan ett antikroppssvar och ett T-cellssvar?

Ett antikroppssvar attackerar extracellulära patogener och de markerar främmande ämnen för förförstörelse eller neutralisation. T-cellssvar innebär aktiviering av andra immunceller, de kan direkt eliminera skadade eller infekterade celler.

Ge exempel på applikationer där man nyttjar antikroppars specificitet och affinitet.

ELIZA, läkemedel(kan målsöka och attackera celler i kroppen kan användas mot cancer), diagnos, affinitetskromatografi.

Ge exempel på hur antikroppar kan användas som läkemedel.

Visa antikroppar kan påverka immunsystemets aktivitet. Kan användas som läkemedel då de riktar in sig på proteiner på ytan av cancerceller t.ex. bröstcancer. Kan passivisera infektioner.

Hur fungerar immunterapi mot PD-1 / PD-L1?

Genom att använda antikroppar binds dessa in på proteinerna nämnda ovan vilket gör att T-cellerna kan utsöndra toxicska ämnen och därmed förgöra cancercellen.

Vad är skillnaden på agonstiska och antagonistiska antikroppar?

Agonistiska antikroppar är stimulerande och binder till immunaktiverande receptorer. Antagonistiska antikroppar är hämmande och binder till immun inhiberande receptorer.

Hur kan man använda immunceller för cancerbehandling?

Man kan använda immunceller genom att en chimeric antigen receptor som nästan är en antikropp som sitter bunden till en T-cell målsöker tumörceller. T-celler från patienten renas upp och modifieras for att binda till tumören. De återförs sedan till patienten. Detta är en dyr process då man måste använda patientens egna T-celler och man måste känna till ett tumörspecifikt antigen.

Vilka är de tre huvudsakliga sätten att framställa antikroppar på lab? Fördelar/nackdelar med metoderna?

Immunisering antigenet som är önskat injeceras i ett djur ofta mus eller kanin. Det ger upphov till ett antikroppssvar. Det ger upphov till antikroppar som kan renas fram ur djurets blod. Fördel är att metoden är välbeprövad, nackdelar att man inte får mänskliga antikroppar samt att man får polyklonala antikroppar.

Hybridom, Man börjar med samma process som ovan men antikroppen som väljs ut sammanfogas med en cancercell vilket leder till att hybridomet blir en antikroppsfabrik. Fördelar är att det är välbeprövat och att man monoklonala antikroppar, nackdelar är att det krävs djur och att man inte får mänskliga antikroppar.

Fagdisplay, DNA som kodar för den antigensbindande delen av antikroppar sätts in i en viruspartikel (fag), därefter uttrycker fagerna bindningsdelen på sin yta. Antigenet immobiliseras på en yta och de fager som binder starkast väljs ut. Selektionen sker i flera rundor och punktmutationer som gör antikropparna bättre sker. De antikroppar som har hög affinitet och specifitet är kvar och de sätts in i celler som odlas på labb. Fagdisplay nackdel inte så välbeprövad, fördel monoklonala och mänskliga antikroppar.

Vad är skillnaden på monoklonala och polyklonala antikroppar? Ge exempel på användningsområden för båda.

Monoklonala antikroppar kommer från samma B-cell, de är homogena alla antikroppar är likadana, lågrisk för korsreaktivitet, lågbakrundssignal. Polyklonala antikroppar kommer från immunisering av djur. Vilket leder till att flera olika B-celler bildas som binder till antigenet. En hetrogen blandning av antikroppar som binder till olika epitop (del på antigen). Ökad risk för korsreaktivitet och bakgrundssignal.

Hur fungerar fagdisplay (i stora drag)?

Fagdisplay, DNA som kodar för den antigensbindande delen av antikroppar sätts in i en viruspartikel (fag), därefter uttrycker fagerna bindningsdelen på sin yta. Antigenet immobiliseras på en yta och de fager som binder starkast väljs ut. Selektionen sker i flera rundor och punktmutationer som gör antikropparna bättre sker. De antikroppar som har hög affinitet och specifitet är kvar och de sätts in i celler som odlas på labb. Fagdisplay nackdel inte så välbeprövad, fördel monoklonala och mänskliga antikroppar.

Varför är det önskvärt att använda humana antikroppar som läkemedel?

För att de inte anses som främmande av kroppen som t.ex.  Musantikroppar kan göra.

Hur fungerar IHC och IF? Vad används teknikerna till?

IHC fungerar genom att en antikropp binder till antigenet till antikroppen binds en till antkropp med ett enzym som när de reagerar med sitt substrat färgas. Då kan man se ett specifikt antigen i taget. IF fungerar genom att en antikropp märks med flourokrom som avger ljus vid visa våglängder. Finns flera olika flourokrom vilket gör att flera olika antigen kan synas på samma gång.

Hur fungerar en ELISA? Vad används tekniken till? Ge exempel på tester där man använder sig av ELISA-principen.

Sandwich ELISA fungerar genom att en antikropp som coatar botten av en brunn, till dessa binder ett protein till vilket en antikropp binds som fäster ett enzym som kan detekteras.

Vad vill man uppnå med vaccinering? Ge exempel på hur man kan ta fram vaccin.

Man vill att immunsystemet ska vara berett på en infektion. Ett vaccin bildas genom att en död eller attenuerad version av en patogen injeceras.

Hur funkar mRNA-vaccin?

mRNA-vaccin fungerar genom att mRNA injeceras i kroppen. Då tillverkar kroppen ett viralt protien(lite mänskligt lite virus) detta reagerar immunsystemet på och antikroppar bildas mRNA kan inte gå in i DNA:et och bryts ner efter translationen.