ŁAŃCUCHOWA REAKCJA POLIMERAZY (PCR)

Po co pcr?

• Możliwość analizy DNA w przypadku bardzo małej ilości

• Duża czułość metody mimo wielu różnych sekwencji

• można dysponować DNA wyizolowanym z jednej komórki

Etapy reakcji

1. Denaturacja dwuniciowego DNA ( 92-96 stopni, 30-60 sek. )

2. Przyłączenie starterów ( 50-65 stopni, 30-60 sek )

3. Wydłużanie starterów 68-72 stopni, 60-120 sek )

Schemat przebiegu reakcji

1. Denaturacja wstępna

2. Denaturacja cykliczna

3. Przyłączanie starterów

4. Synteza

5. Końcowe wydłużanie

6. Przechowywanie

Składniki reakcji

• matryca DNA lub RNA ( cDNA )

• dNTP

• termostabilna polimeraza

• MgCl2

• bufor reakcyjny

• startery bądź sondy TaqMan

Polimeraza Taq - cechy:

• Enzym wytrzymały na ogrzewanie nawet do 96 stopni

• nie wykazuje aktywności 3’-5’ egzonukleazy

• 1-2 błędów na 10 000 nukleotydów

• 1000 par replikuje w ciągu 30 s w temp 72 stopni ( szybka i stania )

• do aktywności wymaga jonów Mg2+

• z Thermus aquaticus

Polimeraza Pfu - cechy:

• termostabilna

• z Pyrococcus furiosus

• Katalizuje w kierunku 5’ → 3’

• Właściwości korektorskie egzonukleazy w kierunku 3’ → 5’

• 8x dokładniejsza niż Taq

• 95% aktywnych cząsteczek po 2h inkubacji w 95 stopniach

• Generuje tępe końce produktu PCR

Materyca - cechy:

• Do reakcji można wykorzystywać DNA lub RNA izolowany z materiału świeżego lub archiwalnego

• Najczęściej w 20 mikrolitrach reakcji stosuje się 10-100 ng matrycy

dNTP

• składniki reakcji

• dostarczają energii do przebiegu reakcji

• stężenie wyjściowe ( 5-10 mM )

• stężenie dNTP w reakcji ( 20-200 μM )

• rozkład dNTP jest częśto przycyzną braku produktu PCR

Startery - cechy

• długość 18-28

• GC powinna stanowić 50-60% sekwencji

• stężenie 0,1-0,5 μM

• metoda doświadczalna

Wybór starterów:

• kompatybilność końców 3’ z matrycą

• na końcu 3’ nukleotydu G albo C

• podobna temperatura topnienia

• unikać powstania dimerów

• unikać sekwencji dających struktury drugorzędowe

Bufor reakcyjny zawiera głównie:

• MgCl2

• KCl

• Tris HCl

• (NH4)2SO4

MgCl2 daje się stężenie ……. stężenie dNTP, po co?

• przewyższające

• zwiększa to dokładność polimerazy

Błędy reakcji PCR

• jakość i zanieczyszczenie matrycy

• startery ( powstawanie dimerów, niska specyficzność )

• złe stężenie dNTP, MgCl2

• błędy polimerazy

• zanieczyszczenie odczynników

• ilość cykli

Real Time PCR cechy:

• wykorzystuje techniki fluorescencyjne

• monitorowanie liczby kopii badanie sekwencji w czasie rzeczywistym

Czym jest CT?

Jest momentem wejścia reakcji w fazę logarytmicznego przyrostu ilości produktu