Tema 4: técnicas generales de preparación de muestras biológicas para la observación de tejidos y células en microscopio óptico

Etapas de la preparación de muestras

1. Disección

2. Fijación

3. Obtención secciones histológicas

   1. Preparación para microtomía

   2. Microtomía

4. Tinción o contranste

5. Montaje

Fijación

Las muestras biológicas se someten a la acción de sustancias químicas (fijadores) o agentes físicos que conservan la estructura de las mismas, deteniendo los procesos de degradación que tienen lugar en los organismos muertos.

Objetivo → Preservar morfología y composición química de células y tejidos

Condiciones de un buen fijador

1. Detiene degradación.

2. Actuar rápido e insolubiliza.

3. Conservar la estructura.

4. Da consistencia.

5. Incrementar la afinidad por los colorantes o mordientes.

Fijación física

Con calor: mechero, microondas. Se usa como complemento de la química.

Con frío: Criofijación, Criosustitución. Es reversible, usada para ME.

Sustancias empleadas en la fijación química

• Aldehídos: forman puentes de unión entre el fijador y las proteínas, preservación molecular y morfológica. Ej: formaldehído.

• Agentes oxidantes: inmovilizan proteínas y lípidos. Ej: tetróxido de osmio.

• Agentes precipitantes/coagulantes: desnaturalizan proteínas, preservación molecular, no morfológica. Ej: metanol, etanol…

Factores que afecta la fijación

1. Tipo de fijación (inmersión, perfusión).

2. Tiempo de fijación. (2h - 3 días)

3. Concentración del fijador.

4. Temperatura de fijación.

5. pH del fijador.

6. Velocidad de difusión (poder de penetración) según tamaño de la pieza. ( d = K √ t )

7. Osmolaridad del fijador.

Preparación para microtomía

Proceso mediante el cual las muestras fijadas se infiltran con un material firme que da consistencia y permite seccionar en cortes delgados de espesor homogéneo. (Parafina → no miscible en agua)

Etapas del proceso de inclusión (IMPORTANTE)

1. Deshidratación: con sustancias hidrófilas que difunden hacia el interior de los tejidos y se intercambian con el agua. En concentraciones progresivamente crecientes (alcohol).

2. Aclaramiento: los agentes deshidratantes no son miscibles con parafina. Por eso se hace un tratamiento intermedio del tejido con disolventes miscibles con agentes deshidratantes (alcohol) y con el medio de inclusión (parafina). Algunos agentes aclarantes son el xileno o el tolueno.

3. Infiltración: progresiva sustitución del agente aclarante por parafina. Por calor, el agente aclarante se evapora y la parafina ocupa su lugar. Se realiza en una estufa a 60º con las siguiente etapas:

   1. Mezclas de agente aclarante y parafina con concentraciones crecientes de ésta (normalmente 2:1, 1:1 y 1:2).

   2. Parafina pura (generalmente 2-3 pasos).

4. Confección del bloque: con moldes de diverso en tamaño, forma y material. Sus etapas son:

   1. Vertido de parafina líquida.

   2. Depósito de la pieza infiltrada.

   3. Solidificación completa de la parafina.

   4. Confección de la pirámide (RETALLADO DEL BLOQUE).

Microtomía

Se obtienen secciones delgadas del tejido:

1. Se gira la manivela del microtomo para producir tiras de la muestra en parafina.

2. Se estiran las secciones (baño de flotación).

3. Se pescan con un portaobjetos.

4. Se adhieren correctamente en una estufa a 40ºC.

Tinción o contraste

Las estructuras tisulares no pueden detectarse con el microscopio óptico convencional, debido a que el índice de refracción de todas ellas es similar: es necesario crear artificialmente un contraste diferencial entre los diversos elementos del tejido.

Técnicas de tinción por coloración

Las moléculas usadas son colorantes (moléculas orgánicas), que se fijan selectivamente a diferentes partes del tejido sin una significativa alteración de la estructura molecular de los mismos.

Tienen 2 partes:

• Grupo cromóforo: radical químico responsable del color.

• Grupo auxocromo: parte de la molécula responsable de la unión a componentes de los tejidos.

Según la naturaleza química del radical auxocromo

• Ácidos o aniónicos: tienen apetencia por sustancias básicas. Ej: Eosina

• Básicos o catiónicos: tienen apetencia por sustancias ácidas del tejido como el ADN. Ej: hematoxilina.

• Neutros: poseen una porción ácida y otra básica (pueden teñir ambas). Ej: Giemsa: varios colorantes.

• Indiferentes o hidrofóbicos: no se unen a elementos de los tejidos por afinidad química sino porque se disuelven en ellos. Ej: Sudán.

¿Por qué los colorantes tiñen los tejidos?

• Afinidad colorante-tejido: capacidad de las moléculas de colorante para desplazarse desde la solución hacia el tejido, debido a:

  • Fuerzas electrostáticas (colorantes iónicos).

  • Fuerzas de van der Waals (tinción de fibras elásticas con orceína).

• Selectividad de tinción: los colorantes se absorben en ciertas estructuras de los tejidos, pero no en otras, debido a:

  • Afinidad selectiva de diferentes estructuras tisulares con el colorante.

  • Diferencias en la velocidad de incorporación del colorante a diferentes estructuras tisulares.

  • Diferencias en la velocidad de pérdida del colorante en diferentes estructuras tisulares.

Clasificación de las técnicas

Coloración vital

Empleo de soluciones muy diluidas de sustancias colorantes no tóxicas, para estudiar a una muestra de células o tejidos. 2 tipos:

• Coloración intravital: introducción por vía digestiva, subcutánea, sanguínea, linfática…

• Coloración supravital: se realiza sobre células libres, extraídas del organismo.

Etapas de la tinción

1. Desparafinización: Nuestro corte aún está impregnado en parafina y para que los colorantes se metan dentro del tejido debemos extraer la parafina con xilol.

2. Hidratación: La hidratación se realiza colocando el portaobjetos en concentraciones decrecientes de alcohol (que extrae el xilol) hasta llegar a agua destilada.

3. Tinción: Una vez hidratada la muestra se pueden aplicar los distintos protocolos según la tinción deseada.

Técnicas de incorporación de metales (impregnación)

No son técnicas de coloración, ya que consisten en el depósito de sales metálicas sobre fibras reticulares y otros elementos determinados de los tejidos.

Montaje

Depósito del cubreobjetos sobre la sección histológica teñida. El objetivo es conseguir el máximo grado de transparencia que asegure una adecuada observación de la sección al microscopio.

Etapas

1. Deshidratación: serie de concentraciones crecientes de un agente deshidratante (alcohol).

2. Aclaramiento: Xilol, carbol-xilol u otro agente aclarante.

3. Montaje: depósito del medio de montaje y del cubreobjetos.

4. Eliminación del medio sobrante y secado.