CM7: iPSC

🔹 DÉFINITION DES CELLULES iPS

• Définir les cellules iPS

Les cellules iPS (Induced Pluripotent Stem Cells) sont des cellules somatiques adultes différenciées qui ont été reprogrammées génétiquement afin de retrouver un état pluripotent, comparable à celui des cellules souches embryonnaires.
Elles possèdent une capacité de prolifération illimitée et peuvent se différencier en tous les types cellulaires de l’organisme.
Elles constituent une alternative aux cellules ES car elles ne nécessitent pas la destruction d’un embryon.

🔹 OBTENTION DES CELLULES iPS / REPROGRAMMATION

• Comment obtenir des iPSC ?

• Quel est le protocole expérimental qui a permis d’obtenir les iPSC (par élimination) ?

• Combien de temps dure l’étape de reprogrammation ?

• Quel est le rendement de cette étape et pourquoi ?

• Combien de temps pour arriver au test qualité ?

🔴 Comment obtenir des iPSC ?

Les iPSC sont obtenues en introduisant artificiellement dans une cellule adulte différenciée des facteurs de transcription de pluripotence, entraînant une reprogrammation épigénétique et transcriptionnelle de la cellule vers un état indifférencié.

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🔴 Quel est le protocole expérimental qui a permis d’obtenir les iPSC (par élimination) ?

L’obtention des iPSC repose sur l’abandon :

• du transfert nucléaire dans un ovocyte énucléé

• du recours à un embryon

• du clonage embryonnaire

À la place, la pluripotence est induite directement dans une cellule somatique adulte par la réexpression de gènes clés, sans passer par un stade embryonnaire.

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🔴 Combien de temps dure l’étape de reprogrammation ?

Environ 2 semaines.

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🔴 Quel est le rendement de cette étape et pourquoi ?

Le rendement est très faible, de l’ordre de 0,5 à 1 % des cellules traitées.
Cela s’explique par :

• la résistance épigénétique des cellules différenciées

• la nécessité de remodeler profondément la chromatine

• l’activation coordonnée de réseaux transcriptionnels complexes

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🔴 Combien de temps pour arriver au test qualité ?

Environ 6 mois, incluant :

• la sélection des clones

• leur amplification

• les contrôles de pluripotence

• les contrôles génétiques et épigénétiques

🔹 REPROGRAMMATION NUCLÉAIRE & CLONAGE

• Qu’est-ce que la reprogrammation nucléaire et à quels types de clonage donne-t-elle lieu ?

🔹 ASPECTS ÉTHIQUES ET LÉGAUX

• Lequel est interdit par la loi de bioéthique ?

🔴 Qu’est-ce que la reprogrammation nucléaire et à quels types de clonage donne-t-elle lieu ?

La reprogrammation nucléaire correspond à la capacité d’un noyau de cellule somatique différenciée à redevenir totipotent ou pluripotent lorsqu’il est placé dans un cytoplasme embryonnaire.
Elle est à l’origine :

• du clonage reproductif

• du clonage thérapeutique

Le clonage reproductif est strictement interdit et qualifié de crime contre l’espèce humaine.
Le clonage thérapeutique est également interdit en France, avec des dérogations très encadrées pour la recherche sur l’embryon.

🔹 CLONAGE REPRODUCTIF

• Étapes et but du clonage reproductif ?

Étapes :

1. Prélèvement d’une cellule somatique chez un individu

2. Extraction du noyau

3. Transfert du noyau dans un ovocyte énucléé

4. Activation de l’embryon

5. Implantation dans un utérus

But :
Donner naissance à un individu génétiquement identique au donneur du noyau (ex : Dolly, 1997).

🔹 CLONAGE THÉRAPEUTIQUE

• Étapes et but du clonage thérapeutique ?

Étapes :

1. Transfert du noyau d’une cellule somatique dans un ovocyte énucléé

2. Développement embryonnaire précoce in vitro

3. Isolement de cellules souches embryonnaires

4. Destruction de l’embryon

But :
Produire des cellules souches génétiquement identiques au patient pour générer des cellules, tissus ou organes sans rejet immunitaire.

🔹 CONTRÔLES QUALITÉ

• Quelle est l’utilité des contrôles qualité ?

🔴 Quelle est l’utilité des contrôles qualité ?

Ils permettent de détecter :

• des mutations ponctuelles

• des aberrations chromosomiques

• des anomalies épigénétiques
  et de garantir la sécurité et la stabilité génétique des cellules iPS avant toute application.

🔹 APPLICATIONS DES CELLULES iPS

• Exemples de thérapies avec des cellules iPS (essais cliniques, banques, criblage)

• Quelles sont les 3 grandes études possibles à partir des iPSC (banque, criblage, thérapie) ?

🔴 Exemples de thérapies avec des cellules iPS

• Essais cliniques au Japon et en France pour la dégénérescence maculaire et la rétinite pigmentaire

• Essais sur les lésions de la moelle épinière

• Banques d’iPS allogéniques compatibles HLA

• Criblage de médicaments (ex : metformine dans la maladie de Steinert)

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🔴 Quelles sont les 3 grandes études possibles à partir des iPSC ?

1. Banques de cellules iPS

2. Criblage pharmacologique à haut débit

3. Thérapie cellulaire

im occ

🔹 MAINTIEN DE L’ÉTAT INDiffÉRENCIÉ (ES & iPS)

• Comment les cellules souches (ES et iPS) maintiennent leur état indifférencié ?

• Que se passe-t-il quand on ajoute des groupements méthyl sur les lysines des histones ?

🔴 Comment les cellules souches (ES et iPS) maintiennent leur état indifférencié ?

Par une répression transcriptionnelle stable des gènes de différenciation via :

• une chromatine condensée

• l’action des complexes Polycomb (PRC1 et PRC2)

• le maintien d’un paysage épigénétique répressif

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🔴 Que se passe-t-il quand on ajoute des groupements méthyl sur les lysines des histones ?

La méthylation de certaines lysines (ex : H3K27me3) entraîne :

• une condensation de la chromatine

• une répression durable de la transcription

• le maintien de l’état indifférencié

🔹 RISQUES DES CELLULES iPS

• Pourquoi, avant, l’obtention de iPS comportait un risque de transformation tumorale ?

• Pourquoi ce risque n’existe plus aujourd’hui ?

• Qu’est-ce qu’un tératome ?

🔴 Comment les cellules souches (ES et iPS) maintiennent leur état indifférencié ?

Les cellules souches ES et iPS maintiennent leur état indifférencié en réprimant durablement les gènes de différenciation grâce à une chromatine condensée et méthylée.
Cette répression est assurée par les protéines Polycomb (PcG), organisées en complexes PRC, qui se fixent sur des séquences régulatrices spécifiques de l’ADN appelées PRE (PcG response elements).
Les complexes Polycomb modifient les histones (notamment H3K27me3), ce qui bloque la transcription des gènes cibles et stabilise l’état pluripotent.

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🔴 Que se passe-t-il quand on ajoute des groupements méthyl sur les lysines des histones ?

La méthylation de certaines lysines (ex : H3K27me3) entraîne :

• une condensation de la chromatine

• une répression durable de la transcription

• le maintien de l’état indifférencié

Definir les cellules iPS

Comment obtenir des iPSC

Critère	Cellules ES (embryonnaires)	Cellules iPS (pluripotentes induites)
Origine
Prolifération
Production
Pluripotence
Immunogénicité
Enjeu éthique
Prélèvement
Modélisation
Reprogrammation
Stabilité génétique
Thérapie cellulaire
Statut global

Que se passe t il quend on rajoute des methyl a des lisines des histone

🔹 GÈNES MAÎTRES DE LA PLURIPOTENCE 🔹 GÉNÉRALITÉS 🔴 Quels sont les gènes « maîtres » de la pluripotence ?

Les trois gènes maîtres de la pluripotence sont OCT4 (Oct3/4), SOX2 et NANOG.
Ils forment un réseau transcriptionnel central qui maintient l’état pluripotent, l’auto-renouvellement et empêche l’entrée en différenciation des cellules ES et iPS.
Ces facteurs s’auto-régulent et se régulent mutuellement en se fixant sur leurs promoteurs respectifs.

🔹 OCT4 (Oct3/4)

🔴 Quel est le rôle d’OCT4 dans la pluripotence ?

🔴 Que se passe-t-il en cas de surexpression ou de sous-expression d’OCT4 ?

🟢 Comment OCT4 est-il régulé au niveau transcriptionnel ?

🔹 OCT4 (Oct3/4) 🔴 Quel est le rôle d’OCT4 dans la pluripotence ?

OCT4 est un facteur de transcription de la famille POU, indispensable au maintien de l’état pluripotent.
Il est exprimé dans les cellules ES indifférenciées et disparaît rapidement lors de la différenciation.
Un niveau précis d’expression est crucial : toute variation entraîne une perte de pluripotence.

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🔴 Que se passe-t-il en cas de surexpression ou de sous-expression d’OCT4 ?

• Surexpression d’OCT4 → différenciation vers l’endoderme primitif et le mésoderme

• Sous-expression d’OCT4 → différenciation vers le trophectoderme

• Expression optimale → maintien de l’état de cellule souche embryonnaire

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🟢 Comment OCT4 est-il régulé au niveau transcriptionnel ?

Le promoteur d’OCT4 contient des sites de liaison pour SOX2, permettant une co-régulation directe.
OCT4 et SOX2 forment un hétérodimère qui active l’expression de nombreux gènes de pluripotence, dont Nanog.

🔹 SOX2 🔴 Quel est le rôle de SOX2 dans les cellules ES et iPS ?

🔴 Que se passe-t-il lorsque le niveau d’expression de SOX2 varie ?

🔴 Quel est le rôle de SOX2 dans les cellules ES et iPS ?

SOX2 est un facteur de transcription de la famille SRY-box, essentiel au développement embryonnaire précoce.
Il participe au maintien de la pluripotence et doit être finement régulé, comme OCT4.
SOX2 agit en synergie avec OCT4 pour maintenir l’état indifférencié.

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🔴 Que se passe-t-il lorsque le niveau d’expression de SOX2 varie ?

• Surexpression de SOX2 (≈ x2) → différenciation vers tous les lignages sauf le mésoderme

• Faible expression de SOX2 → différenciation en trophectoderme

• Expression contrôlée → maintien de la pluripotence

🔹 NANOG

🔴 Quel est le rôle de NANOG dans la pluripotence ?

🔴 Comment NANOG agit-il dans le réseau de pluripotence ?

🟢 Quel est le lien entre NANOG et la voie LIF/BMP ?

NANOG 🔴 Quel est le rôle de NANOG dans la pluripotence ?

NANOG est un facteur de transcription clé requis pour l’auto-renouvellement des cellules ES.
Une diminution de son expression est associée à l’entrée en différenciation.
Sa surexpression est suffisante pour maintenir un haut niveau d’expression d’OCT4.

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🔴 Comment NANOG agit-il dans le réseau de pluripotence ?

NANOG agit de concert avec OCT4 et SOX2 dans un réseau transcriptionnel auto-entretenu.
Il stabilise l’état pluripotent et renforce l’expression des gènes de pluripotence.
Il est indispensable pour empêcher la différenciation spontanée.

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🟢 Quel est le lien entre NANOG et la voie LIF/BMP ?

NANOG agit en coopération avec le LIF (Leukemia Inhibitory Factor),
mais ne module directement ni la voie LIF/STAT3, ni la voie BMP.
Il agit principalement au niveau nucléaire transcriptionnel.

RÉSEAU TRANSCRIPTIONNEL DE LA PLURIPOTENCE 🔴 Comment OCT4, SOX2 et NANOG fonctionnent-ils ensemble ?

Ils forment un circuit d’auto-régulation positive, où chacun active l’expression des autres.
Ce réseau active les gènes de pluripotence et réprime les gènes de différenciation.
Toute perturbation de l’un de ces facteurs entraîne une perte de l’état pluripotent.