analyza transkripcie

transkriptom

Súbor všetkých RNA transkriptov prítomných v bunke v danom okamihu.

➡ Mení sa podľa:

• typu bunky

• prostredia

• aktuálnych potrieb bunky

proteom

Súbor všetkých proteínov vytvorených bunkou.

co sledujeme pri studiu transkripcie

• ci je gen zapnuty - ci vznika jeho mRNA

• aka silna je expresia genu - kolko mRNA vznika

northern blot

• sluzi na zistenie pritomnosti konkretnej mRNA

• urcenie velkosti mRNA

• priblizne porovnanie mnozstva mRNA

northern blot postup

• izolacia RNA

• elektroforeza (pouziva sa denaturujuci gel)

• prenos na membranu (blotting)

• hybridizacia sondou (DNA,RNA) komplementarnej k hladanej mRNA

RNAse protection assay (RPA)

• hybridizacia cielovej RNA a znacenej RNA sondy v roztoku

• komplementarne oblasti vytvoria RNA/RNA duplex

• prida sa RNAza - rozstiepi vsetku jednoretazcovu RNA a duplex zostane chraneny

S1 nuclease protection assay

• narozdiel od RNA je sonda ssDNA alebo dsDNA

• enzym sa pouziva S1 nukleaza - stiepi ssDNA, ssRNA ale nie duplex

• pouziva sa na hladanie intronov/exonov a lokalizaciu zaciatku transkripcie

pri

primer extenstion assay

• cielom nje urcit presny zaciatok transkripcie

• izolacia mRNA

• pridanie znaceneho primeru - blizko 5’ konca mRNA

• reverzna transkriptaza predlzi primer az po samotny 5’ koniec RNA

• elektroforezou sa zmeria dlzka produktu

RT-PCR

• reverse trancription pcr

• pomocou reverznej transkriptazy mRNA → cDNA

• cDNA za pouzije na PCR

Čo vyjadruje pojem transkriptóm?

Úplný súbor transkriptov (molekúl RNA) prítomných v bunke alebo tkanive v danom čase

Prečo množstvo mRNA v bunke nemusí vždy presne korelovať s množstvom výsledného proteínu?

Množstvo mRNA závisí nielen od transkripcie, ale aj od jej stability a efektívnosti translácie

Čo vyjadruje parameter RIN (RNA Integrity Number)?

Mieru neporušenosti (integrity) izolovanej RNA, určenú najmä pomerom pásov rRNA (28S/18S)

Aký je hlavný cieľ Northernova prenosu?

Zistiť prítomnosť špecifickej mRNA vo vzorke, určiť jej relatívnu veľkosť a relatívne množstvo

Prečo sa pri Northern blotovaní vykonáva elektroforéza v denaturujúcom géli?

Aby sa rozrušili sekundárne štruktúry RNA (vlásenky) a molekuly sa delili výhradne podľa dĺžky reťazca

Čo slúži ako vnútorná kontrola správnosti izolácie RNA pri Northern blote?

Analýza pásov ribozomálnej RNA (rRNA), ktoré musia byť po elektroforéze jasne viditeľné a nedegradované

Aký je princíp testu rezistencie k RNáze (RNase Protection Assay, RPA)?

Hybridizácia v roztoku so značenou RNA sondou, po ktorej RNáza degraduje len nespárované jednořetězcové úseky

Na čo sa primárne využíva analýza hybridov DNA-RNA pomocou nukleázy S1?

Na mapovanie intrónov a exónov alebo presnú lokalizáciu začiatku transkripcie.

Ktorý enzým je nevyhnutný pre RT-PCR a aká je jeho funkcia?

Reverzná (spätná) transkriptáza; prepisuje RNA do komplementárnej DNA (cDNA)

Aká je hlavná výhoda RT-PCR v porovnaní s Northern blotom?

Extrémne vysoká citlivosť (možnosť detekcie mRNA v jedinej bunke)

Čo je najpresnejším spôsobom štandardizácie pri Real-Time RT-qPCR?

Použitie paralelnej amplifikácie pomocného („housekeeping“) génu, ktorého expresia sa za testovaných podmienok nemení.

Aký výsledok (farbu) uvidíte na DNA čipe, ak je daný gén exprimovaný v oboch porovnávaných vzorkách (označených červenou a zelenou fluorochrómom) v rovnakej miere?

Žltú (prekrytie signálov)

Čo je princípom subtraktívnej hybridizácie?

Odstránenie spoločných sekvencií mRNA prítomných v oboch vzorkách, aby zostali len tie, ktoré sú špecifické pre testovanú vzorku

Na čo slúži technika RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)?

Na získanie úplnej sekvencie koncov (5' alebo 3') cDNA, ak je známa len časť sekvencie vnútri transkriptu

Čo musí obsahovať reportérsky systém na štúdium promótora?

Regulačnú oblasť (promótor) cieľového génu spojenú s kódujúcou oblasťou ľahko detekovateľného proteínu (napr. GFP, luciferáza)

Ktorá metóda umožňuje sledovať lokalizáciu špecifickej mRNA priamo v tkanive alebo intaktnej bunke?

Hybridizácia in situ (napr. RNAScope)