5 - Immundiagnostik

Radioimmunoassay (RIA)

Bindung eines radioaktiv markierten Antigens an Antikörper. Quantitativen Bestimmung sehr geringer Mengen bestimmter Substanzen und Körperflüssigkeiten.

Enzymimmunoassay (EIA)

Enzym als Marker gesetzt, um Bindung von Antigenen nachzuweisen oder quantifizieren

Fluoreszenzimmunoassay (FIA)

Intensität des Fluoreszenzlicht gemessen, um Konzentration des Antigens zu bestimmen

Antikörper

Gehören zu unsere Immunabwehr, Immunglobuline, Proteine, die von unserem Immunsystem gebildet werden um Krankheitserreger zu erkennen und zu bekämpfen/neutralisieren

Antigene

ein Toxin oder eine andere Fremdsubstanz, die im Körper eine Immunreaktion, insbesondere die Produktion von Antikörpern, auslöst.

Diagnose mithilfe von Antikörpern

• Die Antigen-Antikörper Bindung ist spezifisch, erlaubt den qualitativer und quantitativer Nachweis von Antikörpern und Antigenen

• Kombinationsfähigkeit mit weiteren Substanzen dienen zur Visualisierung

Immundiagnostik

Diagnostik von Erkrankungen mit Hilfe von immunlogischen Methoden. Antigene oder Antikörper werden hergestellt

Mögliche Antigene

• Körperfremd: Bakterien, Viren

• Körpereigene: Proteine bei Autoimmunerkrankungen

Monoklonale Antikörper (mAbs)

• Von einer Zelllinie hergestellt, einen einzigen B-Lymphozyten (weiße Blutkörperchen)

• Binden nur an ein 1 Epitop des bestimmtes Antigen

• Künstlich hergestellte Antikörper

Polyklonale Antikörper

• Von verschiedenen B-Zell-Klonen produziert

• Binden an unterschiedliche Epitope eines Antigens

• Hergestellt durch Immunisierung eines Tieres mit dem Antigen

Epitope

antigene Determinante, bestimmter Abschnitt auf der Oberfläche eines Antigens, der von Antikörpern oder T-Zelle des Immunsystems erkannt und gebunden wird

Lateral Flow Test - Zeichnen

Schnelltest zum qualitativen Nachweis von Stoffen mit markierten Antikörpern.

Lateral Flow Test Verlauf

1. Probenpad: Probe aufgetragen 

2. Konjugatpad: Enthält Antikörper, die an Farbstoffe gebunden sind. Wenn gesuchte Substanz in der Probe vorhanden ist, bindet diese an Antikörper 

3. Nitrozellulose-Membran (Teststreifen):  

   • Testlinie (T): Enthält Antikörper, wenn Substanz vorhanden, Antikörper lagern dort ab -> sichtbare Linie entsteht 

   • Kontrolllinie (C): Bindet unabhängig von der Zielsubstanz immer an den markierten Antikörper -> zeigt, dass Test funktioniert hat 

     • Nur C: Negativ (kein Zielsubstanz gefunden) 

     • Kein C: Ungültig (Test funktioniert nicht korrekt) 

4. Absorptionspad: Sammelt überschüssige Flüssigkeit und sorgt für gleichmäßigen Fluss 

ELISA

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay - immunologisches Verfahren zum quantitativer Nachweis bestimmter Moleküle in Körperflüssigkeiten. Basiert auf der spezifischen Bindung von Antikörpern an Antigene

Direkter ELISA

• Nachweis für Antigene

• 1 fixiertes Antigen,1 Antikörper

1. Probe in Behälter mit Antigen eingeben

2. Antikörper mit Enzym bindet an Antigen

3. Ausgewaschen

4. Substrat bindet an Enzym und wird zum Farbstoff

5. Stärkere Färbung = mehr Antikörper

Indirekter ELISA

• Nachweis: Antikörper, mit Hilfe zweiter Antikörper

• 2 Antikörper,1 Antigen,1 Farbstoff

1. Probe in Behälter mit Antigenen gegeben

2. Vorhandene Primär-Antikörper bindet an Antigene

3. Probe wird ausgewaschen

4. Sekundär-Antikörper mit Enzymen hinzugefügt, bindet an Primär-Antikörper

5. Auswaschen

6. Substrat hinzugefügt, binden an Enzyme und wird zum Farbstoff

7. Stärkere Färbung = mehr Antikörper

Sandwich ELISA

• Nachweis: Antigene, von unten und oben von je einem Antikörper gebunden

• 2 Antikörper, 1 Antigen

1. Probe in Behälter mit Capture-Antikörpern gegeben

2. Antigene binden an Antikörper

3. Auswaschen

4. Primärantikörper binden an Antigene

• Direkt: Primär-Antikörper trägt Enzym

• Indirekt: Primär-Antikörper bindet mit Sekundär-Antikörper, trägt Enzym

5. Färbung

Immunhistochemie

Untersuchung von Geweben durch immunchemischen Methoden

1. Probeentnahme und -bearbeitung: Gewebeproben entnommen und Färbung vorbereitet

2. Färbung: Gewebeschnitte mit Antikörpern behandelt und detektiert

3. Mikroskopische Untersuchung

4. Auswertung: Ergebnisse interpretiert und ausgewertet

Natürliche Herstellung von Antikörper

• Monoklonale Antikörper - B-Zellen (behandelt wie Tumorzellen - Krebszellen mit B-Zellen fusioniert) erkennen Antigen, aktiviert und differenzieren sich zu Plasmazellen.

• Polyklonale Antikörper - Mäuse, infiziert mit Antigenen, Blut genommen und gewinnt Antikörper aus dem Blutserum.

Künstliche Herstellung von Antikörper

• Gentechnisch: DNA-Sequenzen für Antikörper in Wirtszellen eingeführt, um Antikörper zu produzieren

• Hybridomtechik: B-Zellen mit Myelomzellen fusioniert, bilden Hybridomzellen, die unbegrenzt Antikörpern produzieren können

Probleme bei Herstellung von Antikörper

• Qualitätsunterschied bei polyklonalen Antikörper wegen unterschiedlichen Mäusen: Therapie, xenotransplantation - Antikörper von Mäusen sind nicht mit Menschen kompatibel, führt zu HAMA-Antwort → vermindern durch Humanisierung der Antikörper oder Humanisierung der Maus

• Kreuzreaktionen bei polyklonalen Antikörper

• Tierethik

• Unzureichende Produktion: Alter, Geschlecht, genetische Veranlagung oder Begleiterkrankheit 

• Unzureichende Verteilung im Körper und schlechte Zugänglichkeit zu bestimmten Geweben 

• Können die natürliche Funktion des Immunsystems verhindern/verschlechtern 

 

Immundetektion

• mikroskopisch

  • Nutzung der Antigen-Antikörper Bindung zur spezifischen Lokalisation von Proteinen in einem Gewebeschnitt

• biochemisch

  • Auftrennung eines Proteingemischs mittels Gelelektrophorese

  • Transfer der Proteine auf eine Membran (Blotting)

  • Proteindetektion durch Antikörper