약실

박테리아 plate 만드는 실험과 박테리오 파지 plate 만드는 실험의 차이점

박테리아 plate 는 살아 있는 세균이 colony를 형성하고, 파지 plate는 파지에 의해 죽은 E. coli 가 plaque 를 형성한다. 파지 plate 는 IPTG 와 X-gal 이 포함되어 있어 LacZ 유전자 발현 여부를 확인할 수 있다.

전기영동의 목적과 DNA 이동

DNA를 크기 별로 분리하기 위해 전기영동을 사용한다. DNA 는 인산기에 의해 음전하를 띠며, 전기영동 시 (-)극에서 (+)극으로 이동한다. DNA 크기가 작을수록 더 멀리 이동한다.

exp2시약의 사용이유(PEG/NaCl, Iodide buffer, 100% ethanol, 70% ethanol)

1) PEG/NaCl : Phage의 침전에 사용된다.

2) Iodide buffer : phage를 둘러싸고 있는 단백질을 깨서 phage의 DNA를 얻게 하기 위해 사용

3) 100% ethanol : Phage의 DNA 침전에 사용

4) 70% ethanol : washing(불순물 제거용)

exp3시약의 사용이유(loading buffer, EtBr, 1kb ladder)

Loading buffer: 시료를 가라앉히고 진행 정도 확인

분자량이 큰 sucrose, glycerol 등이 함유되어 있어서 DNA가 든 시료를 겔에 가라앉히고 bromo phenol blue가 들어있어서 electrophoresis 도중에 진행정도를 확인하게 해준다.

① Glycerol : 무게를 주어 DNA가 물에 가라앉게 한다.

② Bromophenol Blue : DNA의 이동을 확인한다.

EtBr: DNA 에 끼어들어 자외선 노출 시 형광 발현

1kb ladder: 원하는 size의 DNA가 보이는지 확인하기 위해 size marker를 첫 번째 칸에 loading함

박테리오 파지 PFU, colony와 plaque 차이점 설명

파지는 E. coli 를 감염시키는 바이러스이며, M13 plasmid는 많은 DNA 재조합 과정에 쓰인다. PFU는 plaque 형성 단위이며 PFU/ml를 통해 얼마나 많은 박테리오 파지가 감염되었는지 알 수 있다. colony 는 고체 배지에서 형성되는 single bacterium에 의해서 생기는 응집체, plaque 는 세포가 죽어 생긴 투명한 영역이다.

전기 영동 속도 영향인자 3개와 각각의 원리

1) 크기 : DNA의 크기가 클수록 전기 영동의 이동에 저항이 커짐에 따라 속도가 더 느려진다.

2) 걸어준 전압 세기 : 전기 영동 시 전압을 걸어줄 때 센 전압을 걸어주면 정전기적 힘이 증가 하여 그에 따른 속도가 증가한다.

3) agarose gel 농도 : agarose gel의 농도가 커짐에 따라 DNA가 이동 시 받는 저항이 커져서 느려진다.

exp1 배지에 포함된거 (IPTG, Xgal, 푸른색)

Exp1에 LB/IPTG/Xgal이 포함되어 있다.

1) IPTG : allolactose 유사체로 β-galactosidase를 생산해낸다.

2) X-gal: β-galactosidase에 의해 분해되면 흰색에서 푸른색이 된다. => 플라스미드에 유전자 정상적 삽입 시 IPTG 사이로 들어가서 β-galactosidase생산 X -> X-gal 이 분해 안되서 흰색 / 정상 삽입x 시에는 푸른색

LacZ 유전자의 기능

LacZ 는 β-galactosidase 를 생성하며, 이 효소는 X-gal 을 분해해 파란색을 나타낸다. 이를 통해 유전자 발현 여부를 시각적으로 판단할 수 있다.

LacZ 를 이용한 blue/white screening 원리

M13 파지가 감염되면 결손된 LacZ 유전자가 보완되어 β-gal이 발현되고, X-gal 분해로 파란색 plaque 가 형성된다. 감염되지 않으면 β-gal이 생성되지 않아 흰색 plaque가 생긴다.

serial dilution PFU 계산

10⁻⁹ 희석 시 plaque 8 개 관찰되면, PFU 는 8 × 10¹¹ PFU/mL 이다. (8 × 10⁹ × 희석 역수 × 100μL 기준)

연구 활동 종사자 수의 변경은 LMO 연구시설 변경신고 대상이 아니다. (O/X)

O

LMO 표시, 정보를 알고 있으면 LMO 표시 생략이 가능하다 (O/X)

x

LMO 운반 시 주의해야 할 사항으로 옳은 것은?

1) 운반계획 없이 운반

2) 내용물 흘러도 상관없이 운반

3) 밀폐 및 파손 방지 용기로 운반

4) ?

3

Virus Stock을 serial dilution하여 titration했을 때, 10^(-6)배 희석 샘플에서 10mcg를 취하여 plate를 만들었는데 다음날 plate에 256개의 plaque들이 있었다면, stock의 바이러스 농도는 몇 PFU/mL인가?

2.56×10^10 PFU/mL ((256/0.01)*10^6)

박테리아와 박테리아파지의 Lb/agar 만드는 과정에서 차이점 두가지

• 박테리아는 세균만 배지에 도말하지만, 파지는 먼저 E. coli와 파지를 혼합하여 감염시킨 후 사용한다.

• 파지 실험은 Top agar를 사용하여 LB/IPTG/X-gal plate 위에 덮어주는 overlay 방법을 사용한다.

Bacteriophage titration에서 LB/agar [ ] 면에 날짜, sample 이름 등을 넣어 작성하고, 37도 인큐베이터에 [ ] 방향으로 넣어 16-18 시간 배양했다.

바닥, 뒤집은

Exp 2,3 배지에 뭘 같이 넣을까

IPTG, X-gal

Loading Buffer 내용 [ ] sample + [ ]의 6 x Loading buffer [ ] 이 들어있어 DNA를 가라앉게 한다.

5 μL, 1 μL

Bromophenol blue, Orange G 관련 문제

• Bromophenol blue

  • DNA 이동을 눈으로 추적하는 tracking dye

  • 1% agarose gel에서 약 300 bp DNA와 비슷한 속도로 이동

• Orange G

  • DNA 이동을 추적하는 tracking dye

  • 약 50 bp DNA와 비슷한 속도로 이동

  • Bromophenol blue보다 훨씬 빨리 이동

DNA 이동 속도에 영향을 미치는 요인 4개 (총 7개)

1. size of DNA molecule

2. agarose concentration

3. DNA conformation

4. voltage applied

5. presence of ethidium bromide

6. type of agarose

7. electrophoresis buffer

내독소 구성성분 3개

• Lipid A

• Core oligosaccharide

• O-specific polysaccharide (O-antigen, OPS)

LAL assay에 필요한 장비, 시약으로 틀린 것 고르기

시약

• LAL reagent water

• LAL reagent

• E. coli endotoxin standard

• Unknown sample

소모품

• Endotoxin-free vials(tubes)

• Endotoxin-free tips

장비

• Heating block

• Incubation rack

• Vortex mixer

Endotoxin에 의해 가장 먼저 활성화되는 것 [객]

Factor C

Gel 형성 원리 설명하기

Endotoxin이 LAL 시약 내의 Factor C를 활성화시키면 연쇄적인 효소 반응이 일어나 clotting enzyme이 생성된다. 생성된 clotting enzyme은 coagulogen을 coagulin으로 전환시키며, coagulin이 중합(polymerization)되어 gel을 형성한다.