SDS PAGE

Was ist Elektrophorese, wohin wandern die Teilchen?

Wanderung geladener Teilchen im elektrischen Feld. Negativ geladene wandern zur Anode (+), positiv geladene zur Kathode (−). Trennung eines Gemischs in Zonen.

Welche zwei Kräfte wirken auf ein Teilchen?

Beschleunigende Kraft F_B = q·E (Ladung × Feldstärke, E = U/d) und bremsende Reibungskraft F_R (Stokes: 6πηrv, abhängig von Viskosität und Radius). Im Gleichgewicht wandert das Teilchen konstant.

Wie ist die elektrophoretische Mobilität definiert?

u = v/E (Wanderungsgeschwindigkeit pro Feldstärke). Substanzspezifisch. Bei linearen Polymeren (DNA, SDS-Proteine) ist u umgekehrt proportional zu Länge/Molekülmasse → Trennung nach Größe.

Wofür steht SDS-PAGE?

Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis.

Was bewirkt SDS?

SDS (ein Detergens) lagert sich an Proteine an (~1,4 g/g), überdeckt deren Eigenladung → konstante negative Ladung pro Masseneinheit. Dadurch trennt das Gel nur noch nach Größe.

Wozu β-Mercaptoethanol oder DTT?

Sie spalten Disulfidbrücken und lösen so zusammen mit SDS und Hitze (95 °C) die Sekundär- und Tertiärstruktur auf → vollständige Denaturierung.

Welche Reagenzien braucht man zum Gießen eines SDS-Gels?

Acrylamid/Bisacrylamid (Monomer + Vernetzer), APS (Radikalstarter), TEMED (Katalysator), Tris-HCl-Puffer, SDS und Wasser.

Was ist im Probenpuffer enthalten?

SDS, Reduktionsmittel (β-Mercaptoethanol/DTT), Glycerin (macht die Probe schwer → sinkt in die Tasche), Bromphenolblau (Lauffront) und Tris.

Was bestimmt die Porengröße des Polyacrylamidgels?

Die Acrylamidkonzentration (T = Totalkonzentration) und der Vernetzungsgrad (C). Niedrige % → große Proteine, hohe % → kleine. Acrylamid ist toxisch.

2,6 ml 30%-Acrylamid/Bis in ~10 ml Ansatz — wie viel %?

2,6 ml × 30 % = 0,78 g Acrylamid in 10 ml → ≈ 7,8 % (w/v).

Unterschied Sammelgel vs. Trenngel?

Sammelgel (pH 6,8, weitporig): Proteine werden zu einer scharfen Bande gestapelt (stacking/Isotachophorese). Trenngel (pH 8,8, stärker vernetzt): Auftrennung nach Größe wie in der Zonenelektrophorese.

Wie funktioniert das stacking im Sammelgel?

Bei pH 6,8 ist Glycin fast ungeladen = langsames Folgeion, Chlorid = schnelles Leition. Die Proteine werden dazwischen komprimiert (alle Ionen gleich schnell = Isotachophorese). Im Trenngel (pH 8,8) wird Glycin zu mobilem Glycinat, überholt die Proteine → homogene Feldstärke → Trennung.

Coomassie Brilliant Blue – Eigenschaften?

Nachweisgrenze ~50 ng, semiquantitativ, Fixierung mit Essigsäure. Einfach und häufig verwendet.

Silberfärbung – Prinzip & Eigenschaften?

Ag⁺ bindet an negative AS-Seitenketten, wird zu Silber reduziert → Schwarzfärbung. Sehr empfindlich (~1 ng), aber nicht quantitativ, störempfindlich, viele Waschschritte.

Fluoreszenzfärbung (SYPRO Ruby)?

Bindet selektiv an basische Aminosäuren, Detektion mit Fluoreszenzscanner. Quantitativ über weiten Konzentrationsbereich, sehr sensitiv (~1 ng).

Was ist der isoelektrische Punkt (pI)?

Der pH-Wert, bei dem ein amphoteres Protein als Zwitterion ohne Nettoladung vorliegt.

Was ist die isoelektrische Fokussierung (IEF)?

Proteine wandern in einem pH-Gradienten, bis sie ihren pI erreichen; dort ist die Nettoladung 0 und sie stoppen (fokussieren).

Welche zwei IEF-Technologien gibt es?

pH-Gradient durch Trägerampholyte oder durch einpolymerisierte Immobiline = immobilisierter pH-Gradient (IPG). Immobiline sind Acrylamidderivate mit definiertem pK.

Wie funktioniert die 2D-Gelelektrophorese?

Trennung nach zwei Parametern: 1. Dimension IEF (nach pI), 2. Dimension SDS-PAGE (nach Größe). Trennt bis zu ~10.000 Proteinspezies; jeder Spot = ein Protein, wird per MALDI-TOF-MS oder Edman-Abbau analysiert.

Was ist DIGE, Vorteil gegenüber normaler 2D?

Differenz-Gelelektrophorese: zwei Proben mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen (Cy3, Cy5) markiert, gemischt, auf EIN Gel aufgetragen; Cy2 als interner Standard. Vorteil: beide Proben im selben Gel → keine Gel-zu-Gel-Schwankungen, quantitativ (25 pg, über 5 Größenordnungen).