biochemia lab - białka/cukry kolokwium

wiązania w białkach a ich struktura

1° - wiązania peptydowe

2° - wiązania wodorowe (między -NH a -CO łańcucha głównego)

3°/4° - oddziaływania hydrofobowe, van der waalsa, jonowe; wiązania wodorowe, wiązania kowalencyjne (mostki disulfidowe)

struktura 3°/4° rzędowa białek - między jakimi aminokwasami wiązania

kwaśne/zasadowe - oddziaływania hydrofobowe

cysteina - mostki disulfidowe

aminokwasy alifatyczne (6)

glicyna - Gly - G
alanina - Ala - A
prolina - Pro - P
walina - Val - V
leucyna - Leu - L
izoleucyna - Ile - I

aminokwasy aromatyczne (3)

• fenyloalanina - Phe - F

• tyrozyna - Tyr - Y

• tryptofan - Trp - W

aminokwasy siarkowe (2)

• metionina Met M

• cysteina Cys C

aminokwasy polarne (4)

• seryna - Ser - S

• treonina - Thr - T

• asparagina - Asn - N

• glutamina - Gln - Q

aminokwasy zasadowe (3)

• histydyna - His - H

• lizyna - Lys - K

• arginina - Arg - R

aminokwasy kwaśne (2)

• kwas asparaginowy - Asp - D

• kwas glutaminowy - Glu - E

punkt izoelektryczny

=pH, w którym ilość dodatnich i ujemnych ładunków w białku równoważy się

pH w zależności od pI - forma białka

pH > pI - cofnięcie jonizacji grup zasadowych (-)

pH < pI - cofnięcie jonizacji grup kwasowych (+)

pH = pI - jon obojniaczy

właściwości białka w punkcie izoelektrycznym

• najmniejsza rozpuszczalność białka

• najbardziej wytrącone

• najmniejsza otoczka hydratacyjna

• nie wędruje w polu elektrycznym

dlaczego w pH=pI białko ma najmniejszą rozpuszczalność?

jego ładunek netto = 0, więc jego oddziaływania z dipolami wody są bardzo małe. maleje otoczka hydratacyjna, więc następuje agregacja i wytracanie białka

otoczka hydratacyjna

cząsteczki H₂O obecne na powierzchni białka, łączące się z nim wiązaniami wodorowymi

wiązania wodorowe między białkiem a dipolami wody

• azot i tlen wiązania peptydowego

• grupy łańcuchów bocznych zdolne do jonizacji

wysalanie

odwracalne obniżenie rozpuszczalności białka przez dodanie soli - białko traci otoczkę hydratacyjną, bo dipole wody łączą się z jonami soli

wsalanie

zwiększenie rozpuszczalności białka po dodaniu niewielkiej ilości prostych soli

w jaki sposób możemy podzielić białka na podstawie wysalania?

wysalamy białka w 50% nasyconym roztworze i odwirowywujemy:

• osad - białka wysolone - globuliny

• supernatant - białka rozpuszczalne mimo wysokiego stężenia - albuminy

jakiej soli można użyć do wysalania białek

siarczan amonu NH₄SO₄

odsalanie

pozbycie się z roztworu białek nadmiaru soli; wykonujemy filtrację żelową (sączenie molekularne)

na czym polega sączenie molekularne (filtracja żelowa)

rozdzielamy składniki próbki na podstawie wielkości cząsteczek; w przypadku odsalania różnicujemy między dużymi cząsteczkami białek a małymi jonami soli

filtracja żelowa preparatu wysolonego białka

nakładamy preparat na złoże; najpierw eluują cząsteczki duże, czyli białka, a później małe, czyli jony soli

dlaczego w filtracji żelowej eluują najpierw duże cząsteczki?

w kolumnie znajduje się porowate złoże; duże cząsteczki przechodzą szybko między ziarnami złoża, a małe wnikają w jego pory, więc mają do pokonania dłuższą drogę

złoże w filtracji żelowej - wielkość porów

im mniej wody wiąże złoże, tym mniejsze pory - jony soli są małe, więc do odsalania białek najlepsze jest złoże z małymi porami

widmo białka w UV-VIS

• peak w 210-230 nm - wynik wiązań peptydowych o częściowo podwójnym charakterze

• peak w 280 nm - charakterystyczny dla reszt aromatycznych (tryptofan i tyrozyna) + wiązań disulfidowych (cysteina)

oznaczanie stężeń białka - metody

1. metoda bezpośrednia - pomiar absorpcji w UV

2. metoda pośrednia - metody kolorometryczne

   a) metoda biuretowa

   b) metoda Bradforda

oznaczanie stężeń białka - metoda bezpośrednia

korzystamy wtedy, gdy mamy jedno białko; pomiar A₂₈₀ i gdy znamy ε/a możemy obliczyć stężenie białka

oznaczanie stężeń białka - metoda pośrednia

mierzymy absorpcję w VIS przez barwne kompleksy, które białka tworzą z innymi związkami

stężenie wyznaczamy na podstawie krzywej standardowej, używamy głównie do mieszanin białek

metoda biuretowa/Bradforda

współczynniki absorpcji

a - właściwy - dm³/gxcm (stężenie wychodzi mg/ml)

ε - molowy - dm³/molxcm (stężenie wychodzi M)

jak z absorbancji wyliczyć absorbancję właściwą?

A/cxl (stężenie w μg/ml)

metoda biuretowa - charakterystyka

wykrywanie ilości białka; metoda pośrednia, kolorometryczna, mniej czuła niż Bradford

metoda biuretowa - zasada działania

atomy azotu wiązań peptydowych tworzą fioletowe kompleksy z jonami miedzi (Cu²⁺)

metoda biuretowa - środowisko reakcji

środowisko zasadowe

metoda biuretowa - interpretacja wyników, metoda

pomiar A₅₄₀ - intensywność fioletowej barwy wprost proporcjonalna do stężenia białka, na podstawie krzywej poznajemy ilość białka

metoda Bradforda - charakterystyka

wykrywanie ilości białka; metoda pośrednia, kolorometryczna, bardzo czuła

metoda Bradforda - zasada działania

CBB wiąże się z białkami za pomocą wiązań jonowych/hydrofobowych i powstały kompleks przyjmuje niebieską barwę

metoda Bradforda - barwnik

CBB (G/R-250) - Coomassie Briliant Blue, błękit brylantowy

z jakimi resztami aminokwasowymi łączy się CBB?

zasadowe - Arg, His, Lys

aromatyczne - Tyr, Trp, Phe

metoda Bradforda - środowisko reakcji

środowisko kwaśne

metoda Bradforda - interpretacja wyników, metoda

pomiar A₅₉₅ - intensywność niebieskiej barwy wprost proporcjonalna do stężenia białka, na podstawie krzywej poznajemy ilość białka

CBB tworzy kompleksy białko-barwnik i zmienia barwę z brunatnego na niebieski

elektroforeza - na czym polega

migracja naładowanych cząsteczek w kierunku elektrody o ładunku przeciwnym

od czego zależy szybkość wędrówki w normalnej elektroforezie

• natężenie pola elektrycznego

• ładunek cząsteczki

• współczynnik tarcia

• siła jonowa elektrolitu

• pH, temperatura

cechy nośnika w elektroforezie

• elektrycznie obojętny

• nieaktywny chemicznie

• porowaty

• żel - działa jako sity molekularne i tłumi prądy konwekcyjne

elektroforeza SDS PAGE

elektroforeza w żelu poliakryloamidowym w warunkach denaturujących

od czego zależy szybkość wędrówki w SDS PAGE?

tylko od masy cząsteczkowej białka

żel poliakryloamidowy - składniki

• akryloamid

• bisakryloamid

• APS - nadsiarczan amonu

• TEMED

akryloamid

monomer poliakryloamidu, tworzy łańcuchy

bisakryloamid

czynnik sieciujący, ko-monomer

APS i TEMED

nadsiarczan amonu + trzeciorzędowa amina, system kataliza/inicjacja, ułatwiają tworzenie wolnych rodników do polimeryzacji

PAGE - sieciowanie

im większe stężenie bisakryloamidu tym mniejsze pory

SDS PAGE - żel zagęszczający

stacking gel, pH=6,8, nakładany na górę, dzięki niemu wszystkie białka dochodzą do żelu rozdzielającego w tym samym czasie

SDS PAGE - żel rozdzielający

separating gel, pH=8,8, umożliwia rozdzielenie białek w zależności od ich rozmiaru

SDS PAGE - używane bufory

bufor elektrodowy + bufor do analizy/denaturacji

bufor elektrodowy - skład

TRIS, glicyna, chlor - pH=8,3

bufor do analizy/denaturacji - skład i funkcja

zapewnia strukturę pierwszorzędową

• SDS

• B-merkaptoetanol (BME)/DTT

• błękit bromofenolowy

• glicerol

SDS - funkcja w PAGE

• niszczy oddziaływania niekowalencyjne w natywnych białkach

• ma silnie ujemny ładunek; otacza białka ładując je ujemnie (wędrówka do anody)

SDS - skrót

sól sodowa siarczanu dodecylu

• B-merkaptoetanol (BME)/DTT

czynnik redukujący, zrywanie mostków disiarczkowych (zrywanie wiązań kowalencyjnych)

błękit bromofenolowy w SDS PAGE

pełni rolę barwnika

glicerol w SDS PAGE

zwiększa gęstość próbki

co zapewnia denaturację w SDS PAGE?

• SDS zrywająca oddziaływania niekowalencyjne

• BME/DTT zrywająca mostki disulfidowe

• ogrzewanie próbki

monosacharydy - przykłady aldoz

aldehyd glicerynowy, glukoza, galaktoza, ryboza, mannoza

monosacharydy - przykłady ketoz

dihydroksyaceton, fruktoza

szereg konfiguracyjny D/L

patrzymy na węgiel przedostatni licząc od grupy aldehydowej:

-OH po prawej → D
-OH po lewej → L

monosacharydy - forma łańcuchowa/pierścieniowa

cukry z 4 lub więcej węglami tworzą formy pierścieniowe poprzez utworzenie mostka tlenowego i tworzenie wewnątrzcząsteczkowych wiązań półacetalowych

monosacharydy - forma cykliczna

• nie zawiera wolnej grupy aldehydowej/ketonowej

• ma węgiel anomeryczny (dodatkowy węgiel chiralny)

monosacharydy - anomeria

istnienie dwóch form tej samej cyklicznej postaci monosacharydu, różniących się orientacją przestrzenną atomu węgla (1 u aldoz/ 2 u ketoz)

mutarotacja

zmiana wartości skręcalności optycznej anomerów w wyniku zmiany ich proporcji (jedna forma przechodzi w drugą), aż do osiągnięcia stanu równowagi

sacharoza - monocukry/wiązanie

glukoza/fruktoza

α,β-1,2-O-glikozydowe

dlaczego sacharoza jest cukrem nieredukującym, a laktoza i maltoza są redukujące

sacharoza: grupy -OH przy półacetalowym węglu obydwu monosacharydów tworzą wiązanie

maltoza i laktoza mają wolną grupę -OH przy półacetalowym węglu

laktoza - monocukry/wiązanie

β-1,4-O-glikozydowe

galaktoza/glukoza

maltoza - monocukry/wiązanie

α-1,4-O-glikozydowe

glukoza/glukoza

polisacharydy

celuloza, skrobia, glikogen

celuloza

nierozgałęziona, wiązania β-1,4-glikozydowe

skrobia i glikogen - wiązania

α-1,4-glikozydowe - fragmenty łańcuchowe

α-1,6-glikozydowe - rozgałęzienia

dwie frakcje skrobi

amyloza - nierozgałęziona
amylopektyna - rozgałęzniona

enzym rozkładający skrobię

α-amylaza

lektyny

białka/glikoproteiny wiążące ugrupowania cukrowe w sposób specyficzny i odwracalny

właściwości redukujące cukrów

w środowisku zasadowym cukry występują w formie łańcuchowej - cukry redukujące mają wolną grupę karbonylową i mogą dzięki temu utlenić się do kwasu

cukry redukujace

• monosacharydy

• dwucukry z wolną grupą -OH przy węglu półacetalowym

cukry nieredukujące

• polisacharydy

• sacharoza - wiązanie 1,2-glikozydowe tworzone z udziałem dwóch węgli anomerycznych

wykrywanie redukujących właściwości cukrów

• próba Benedicta

• próba Barfoeda

próba Benedicta - zastosowanie

wykrywanie cukrów redukujących

próba Benedicta - metoda, zasada działania

do próbki dodajemy odczynnik Benedicta i ogrzewamy

czerwony osad i zmiana barwy roztworu oznacza, że w próbce znajdował się cukier redukujący (kationy miedzi Cu²⁺ redukują się do Cu⁺)

próba Benedicta - interpretacja wyniku

na podstawie barwy roztworu możemy szacować stężenie - osad w mniejszych ilościach barwi roztwór na zielono, potem na żółto do czerwonego

próba Benedicta - środowisko

zasadowe - cukry w formie łańcuchowej, ketozy ulegają tautomeryzacji

próba Barfoeda - zastosowanie

rozróżnienie monosacharydów i disacharydów redukujących

próba Barfoeda - metoda

dodajemy odczynnik Barfoeda i ogrzewamy (krótkie ogrzewanie!)

próba Barfoeda - środowisko

lekko kwaśne

próba Barfoeda - zasada działania

tak samo jak próba Benedicta (Cu²⁺→ Cu⁺, czerwony osad), ale w środowisku kwaśnym reakcja ta zachodzi wolniej - monosacharydy dają pozytywny wynik (czerwony osad) wkrótce po ogrzaniu, a disacharydy po (znacznie) dłuższym czasie, bo ich grupa karbonylowa jest mniej aktywna

różnica między próbami Barfoeda a Benedicta

Benedict - cały roztwór się barwi

Barfoed - tylko czerwony osad

Benedict - środowisko zasadowe

Barfoed - środowisko kwaśne

Benedict - wykrywa mono i disacharydy redukujace

Barfoed - wykrywa tylko monosacharydy

dehydratacja monocukrów - warunki

• podwyższona temperatura

• stężone kwasy

co powstaje w wyniku dehydratacji monocukrów?

pochodne furfuralowe:

pentozy - furfural

heksozy - 5-hydroksymetylofurfural

jakie cukry najłatwiej ulegają dehydratacji?

1. pentozy

2. heksozy - ketozy

3. heksozy - aldozy

próba Molischa - zastosowanie

próba ogólna na cukry

próba Molischa - zasada działania, metoda

1) dehydratacja cukrów kwasem

2) powstają pochodne furfuralowe które łączą się z alfa-naftolem dając czerwono-fioletowe zabarwienie

wady próby Molischa

wynik nie jest specyficzny dla cukrów; pozytywny wynik dają też aldehydy, aceton, kwasy organiczne

próba Molischa - połączenia pochodnych furfuralowych z alfa-naftolem

połączenia triarylometanowe

próba Seliwanowa - zastosowanie

odróżnianie aldoz od ketoz

próba Seliwanowa - metoda, zasada działania

1) krótkie (!) ogrzewanie z odczynnikiem Seliwanowa

2) kondensacja pochodnych furfuralowych z rezorcyną - pomarańczowo-czerwone zabarwienie

w środowisku kwaśnym dehydratacji łatwiej ulegają ketozy, więc to one ulegną dehydratacji i dają pozytywny wynik próby (aldozy niezmienione)

jeśli będziemy ogrzewać dłużej, to aldozy też ulegną dehydratacji

kwaśna hydroliza (nieenzymatyczna) oligosacharydów

pod wpływem mocnych kwasów wiązania glikozydowe ulegają hydrolizie - podwyższona temperatura przyśpiesza tę reakcję