Diversité des polypeptide et purification des protéines 

Variabilité des polypeptides pour une protéine

kamm il y a 20 acides aminés différents pour chaque position d’acides aminés dans la protéine nous avons 20 choix et donc au total

20^n avec n positions

→ bcp bcp bcp de protéines possibles

Quelle est la protéine la plus grande

titine avec +34’000 a.a.

Reihenfolge

= séquence

→ structure primaire

la séquence de l’insuline

Elle est composé d’une chaîne A et une chaîne B relié par des ponts disulfures Inter chaînette. Il y a aussi un pont disulfure Intras chaînette sur A. les ponts disulfures se font sur les cystéine.

Importance de la pureté de la protéines

il faut purifier la protéine pour pouvoir l’analyser, c’est-à-dire trouver sa séquence d’a.a. et son activité enzymatique

Problème pour la purification

• il n’y a peut-être pas beaucoup d’exemplaires de cette protéine

• la protéine qui nous intéresse et parmi des milliers d’autres protéines

• une stratégie de purification est nécessaire

• je dois pouvoir l’observer au cours de la purification

critères grâce auquel on peut différencier les protéines

les propriétés physico-chimiques

• solubilité

• charge ionique

• polarisation

• taille

• spécificités des liaisons

quelle procédure utilise-t-on si

Une protéine à une solubilité spécifique

salting out / salage/ aussalzen

il y a un principe avec d’abord du salting in les ions du sel dissout dans l’eau masquent la charge effective de la protéine. Si on augmente la concentration de sel dans l’eau et donc des ions ceci vont avoir tendance à plutôt interagir avec les molécules d’eau, ignorant la protéine et les protéines précipiteront ensemble

il faut donc une concentration de sel spécifique pour précipiter la protéine voulue

quelle procédure utilise-t-on si la protéine a

une charge ionique

ion exchange chromatographie

Électrophorèse

isoélectrique focusing

quelle procédure utilise-t-on si la protéine a

polarité spécifique

hydrophobic interaction chromatographie

quelle procédure utilise-t-on si la protéine a

une taille spécifique

gel filtration chromatographie

SDS page

quelle procédure utilise-t-on si la protéine a des liaisons spécifiques

affinity chromatography

La chromatographie

il y a deux phases, une solide et une liquide.

• Une phase stationnaire polaire

  exemple cellulose du papier

• une phase mobile apolaire

  exemple: essence

→ les substances se séparent selon leur polarité, en effet les molécules polaires auront tendance à s’accrocher à la phase stationnaire polaire elle aussi et les molécules à polaire seront poussés avec le liquide

Chromatographie en colonne

C’est un peu le même principe que la chromatographie sur papier mais à la place d’utiliser la capillarité on utilise une pompe qui fait circuler en liquide dans une colonne. Les molécules qui ont une meilleurs affinité avec la face solide prendront plus de temps à être nettoyées

ion exchange chromatography (anion exchange)

il y a une paroi composée de molécules positives, la solution qui traverse cette paroi, contient des acides aminés. Les acides aminés négatifs resteront collés contre la paroi positive seulement les acides aminés positifs sortiront de l’autre côté

qu’est-ce que ça veut dire qu’une protéine eat pure à 98 %?

Dans un mélange de sang molécules 98 molécules seront la protéine souhaitée

Électrophorèse

Nous faisons passer un courant électrique dans un gel. la cathode (- car on force un courant) est vers le début et l’anode (+) vers la fin. les molécules négatives (donc la plupart des protéines à un pH 9 se déplaceront jusqu’à l’anode

Afin de visualiser les protéines nous pouvons utiliser des couleurs comme les anticorps

SDS page ressemble à l’électrophorèse mais normalement c’est plutôt pour les trier par taille

dénaturation des protéines par SDS

nous pouvons déplier une protéine si nous utilisons des molécules d’une certaine charges qui vont former une couche autour de celle-ci et l’empêcher de se refermer

Pourquoi séquencer des protéines?

• trouver la structure et la fonction

• comparer des séquences et comprendre l’évolution

• faire des tests de protéines

→ maintenant on séquence au niveau des protéines et de l’ADN

L’évolution des protéines

théorie de Darwin

il y a la sélection d’un avantage

si une mutation homozygote elle étale alors elle disparaît/ sinon elle peut rester présenter un autre avantage (ex anémie falciforme)