TP biochimie : la purification du blanc d'eau

Quelle est la taille du lysozime ?

14,6 kDa

Pourquoi le lysozyme est la seule protéine du blanc d’oeuf étant chargé positivement dans un tampon à pH 10 ?

Car son pKa = 11 > 10 et les autres protéines ont un pKa < 10

Pourquoi la résine se lie uniquement au lysozyme ?

Car elle est chargée + et attire le -

De quoi est formé le culot après centrifugation de la résine mélangé aux protéines du blanc d’oeuf ?

résine + lysozyme

A quoi servent les différents lavages à pH 10 ?

Ils permettent de conserver uniquement les protéines chargées + (lysozymes) qui interagissent avec la résine

Qu’est ce qu’une élution ?

la récupération des protéines liées à la résine

Comment faire une élution ?

on ajoute le tampon à pH 10 + NaCl au culot qui à été préalablement lavé. Na+ intéragissent avec la résine et prennent la place du lysozyme → échange de cations

Le lysozyme sera récupéré → éluat

Où peut-il y avoir des contaminations lors de l’expérience ?

si les lavages ne sont pas efficaces, lors de l’élution → dans les derniers éluat

Qu’est ce que la méthode de Bradford ?

une méthode de dosage colorimétrique (bleu de Coomassie) qui dose la présence de protéines (NON SPECIFIQUE) dans l’échantillon

Comment faire pour rendre l’analyse de Bradford quantitative ?

il faut un référentiel, dans notre cas, une droite de BSA

plus il y a d’absorbance…

plus il y a de protéines dans l’échantillon

Quel est l’autre nom du lysozyme ?

“antibiotique corporel” car il est capable de lyser la paroi des bactéries

1 unité d’enzymes =

quantité d’enzyme nécessaire pour observer une diminution d’absorbance de 0,001 en 1 min

A quoi sert le SDS page ?

séparer les protéines en fonction de leur poids moléculaire indépendamment de la charge et de la forme tridimensionnelle

Comment préparer un échantillon pour le SDS page ?

-beta-mercaptoéthanol → rupture des ponts disulfures

-SDS → donne une charge globale -

-bleu de bromophénol → visualisation (couleur)

-glycérol → augmente la densité de l’échantillon ce qui facilite son dépot dans les puits du gel

-chauffer l’échantillon → finaliser la dénaturation

Comment avoir des valeurs quantitatives avec le SDS page ?

comparé à un marqueur de poids moléculaire

Comment voir les protéines dans le SDS page ?

coloration à l’argent → Ag+ se lie avec certains aa (AgNO3) → Ag+ réduit en Ag qui lui est visible