PRÀCTICA 3 - electroforesi SDS-PAGE

Què és l’electroforesi?

És una tècnica que consisteix en la separació de molècules carregades per aplicació d’un camp elèctric.

Quins factors poden (o no) afectar en el desplaçament de la mostra en una electroforesi?

• Intensistat de càrrega (opcional)

• Massa molecular

En el cas de l’electroforesi desnaturalitzant SDS en gel d’acrilamida és únicament dependent de la massa molecular. 

De què ens serveix ara fer l’electroforesi en gel de policrilamida amb SDS?

Per esbrinar el grau de puresa de la nostra preparació proteica, i a més ens informa sobre la massa molecular de les proteïnes presents.

Aquesta tècnica no ens permet quantificar les proteïnes de la mostra, però sí saber quants tipus de proteïnes diferents hi ha.

De què està compost el gel de la SDS-PAGE?

De poliacrilamida.

De què depèn la velocitat en la qual migren les proteïnes a través del gel?

Depèn de la seva massa molecular: com més petites són, més ràpid migren.

Per tant, la seva velocitat és inversament proporcional al logaritme de la seva massa molecular.

Quina funció té el detergent aniònic SDS?

Desplega les cadenes polipeptídiques i les embolcalla de càrrega negativa, emmascarant la càrrega intrínseca de la proteïna. 

(( important com hem dit que embolcalla les proteïnes que nosaltres volem analitzar de càrrega negativa → quan fem una electroforesi SDS-PAGE només ens centrem en separar en funció de massa moelcular, sense tenir en compte la càrrega de cada proteïna. Però a un mateix pH les proteïnes que nosaltres volem analitzar poden tenir càrregues diferents, i per assegurar-nos que aquest fet no influenciï en la rapidesa amb la qual corren pel gel, les embolcallem totes de càrrega negativa mitjançant el detergent aniònic i així aniran totes cap al pol positiu amb una velocitat que diferenciarà únicament en funció de la seva massa molecular. ))

Segons tot el que hem dit abans, un cop aplicat el detergent aniònic SDS, què és el que frenarà diferencialment la migració dels complexos SDS-proteïna?

Serà únicament la xarxa de policrilamida la que frenarà la migració dels complexos SDS-proteïna en funció de la seva grandària.

Què és el que determina el rang de fraccionament del gel?

Serà la mida dels porus del gel, que vindran determinats per la concentració d’acrilamida i bisacrilamida a la que s’ha polimeritzat el gel.

Què és una SDS-PAGE discontínua? Què implica?

És una electroforesi formada per 2 gels: un més “permissiu” i l’altre menys. Aquesta variant incrementa la resolució de l’electroforesi gràcies al fet que els complexos SDS-proteïna passen seqüencialment per dos gels:

• el gel superior és el gel apilador, on la xarxa de policrilamida és laxa i TOTES LES PROTEÏNES MIGREN A LA MATEIXA VELOCITAT

• el gel inferior és el gel separador, on la xarxa de poliacrilamida és més densa i les proteïnes SE SEPAREN EN FUNCIÓ DE LA SEVA MASSA MOLECULAR.

Què és el betamercaptoetanol i per què serveix?

És un agent reductor. Trenca els ponts disulfur que estabilitzen l’estructura terciària i quaternària de les proteïnes.

Fa que: 

1. Les proteïnes estiguin desnaturalitzades (sense estructura tridimensional).

2. Cadascuna tingui una càrrega negativa proporcional a la seva mida (gràcies al detergent SDS).

Així doncs, podem dir que el detergent de l’electroforesi és l’SDS, i el β-mercaptoetanol l’ajuda reduint els ponts disulfur per aconseguir una desnaturalització total.

Quina substància de l’electroforesi és neurotòxica?

L’acrilamida (quan no està polimeritzada). Cal anar amb guants. 

Què és el TEMED i quina funció té?

és una de les substàncies clau per a la polimerització del gel de poliacrilamida, actua com a catalitzador en la reacció que forma el gel (Sense TEMED, la polimerització seria molt lenta o incompleta, i el gel quedaria tou o irregular).

Quina solució de tinció utilitzem?

el blau de Comassie Brilliant Blue

En la preparació del gel superior i inferior, hi ha 2 ingredients que no s’han de posar fins l’últim moment. Quins són?

El TEMED i el persulfat, que s’han de preparar just abans d’usar-lo, ja que un cop els hem afegit la reacció comença immediatament.

Per què es posa aigua sobre la preparació recent de gel inferior, abans de posar-hi el gel superior a sobre?

per evitar que s’assequi i que faci forma de menisc.

Per què s’afegeix tampó d’aplicació a les mostres d’ovoalbúmina abans de carregar-les al gel?

Perquè el tampó d’aplicació conté glicerol, que proporciona gran densitat a la mostra d’ovoalbúmina i evita que surti de la butxaca al moment d’aplicar-la. A més, conté el colorant blau de bromofenol (BPB), beta-mercaptoetanol (que ja hem dit la seva funció anteriorment) i SDS (detergent, que acaba de desplegar les prot. i les embolcalla amb la càrrega negativa).

De què serveixen els 2 tints que han aparegut durant el procediment?

1. Blau de bromofenol (BPB) → forma part del tampó d’aplicació, que s’afegeix a la mostra d’ovoalbúmina abans de carregar-la. La seva funció no és tenyir com a tal, sinó actuar com una molècula petita (no entenc gaire la funció exacta que té). 

2. Blau de Comassie → s’afegeix un cop el gel està polimertizat, les mostres ja carregades i tot ja estigui fet. Llavors, es submergeix el gel al blau de comassie perquè es pugui veure bé on ha parat de correr cada molècula.