Bazunia inżynieria 2025 cz.2

Wektory oparte na innych wirusach

• HSV,

• HPV,

• EBV,

• SV40,

• atenuowane alfawirusy 

Sztuczne chromosomy jako wektory ekspresyjne:

• YAC - sztuczny chromosom drożdżowy - oparty na Saccharomyces cerevisiae

• HAC - sztuczny chromosom ludzki 

• BAC - sztuczny chromosom bakteryjny 

rodzaje mutagenezy

kompetencja

 nie zawsze występuje w sposób naturalny, więc można ją wywołać zewnętrznymi sposobami: fizycznie, chemicznie lub biologicznie.

metoda chemiczna wywoływania kompetencji

Jony wapnia Ca2+ powodują strukturalne zmiany w ścianie komórkowej E. coli i neutralizują ujemne ładunki DNA i ładunki po zewnętrznej stronie błon komórkowych, dzięki czemu DNA może się zbliżyć do powierzchni komórek.

jony Ca2+ tworzą

ośrodki krystalizacji, które odsuwają LPS tworzące błonę komórkową. Przez szok cieplny (0’C -> 42 ‘C -> 0’C) w komórce tworzą się pory, przez które wchodzi nasze DNA, cyk błona się zamyka.

metoda fizyczna wywoływania kompetencji

• działanie temperatury (szok cieplny) — patrz wyżej: 0 ‘C -> 42 ‘C -> 0 ‘C. Tworzą się pory -> DNA wnika do komórki -> błona się domyka

• elektroporacja

elektroporacja

transfer DNA ze środowiska do komórek bakteryjnych przy użyciu prądu elektrycznego. Komórki w fazie wzrostu logarytmicznego (te, które chcemy transformować) umieszczamy w buforze 10% glicerolu i poddajemy działaniu krótkich impulsów wysokiego napięcia prądu elektrycznego, dzięki czemu następuje przejściowa destabilizacja błon komórkowych (pojawiają się pory) i DNA może wniknąć do środka.

metoda chemiczno-fizyczna wywoływania kompetencji

1. hodowla z czynnikiem selekcyjnym: 

2. Komórki E. coli wrażliwe na ampicylinę traktujemy roztworem zimnego roztworu CaCl2 (stąd jony wapnia). Plazmidy z genem oporności na ampicylinę są dodawane do naszych komórek. 

3. Przeprowadzamy szok cieplny (42’C), ochładzamy do 0’C, a następnie ogrzewamy do 37’C, dzięki czemu niektóre komórki pobierają nasz plazmid z selekcyjnym genem oporności. 

4. Gotowe komórki wysiewamy na podłoże agarowe z ampicyliną (antybiotykiem, który jest naszym czynnikiem selekcyjnym) i inkubujemy.

5. Na podłożu wyrastają tylko te kolonie, które do których wniknął przygotowany przez nasz plazmid (ten, który zawierał gen oporności na ampicylinę), komórki które nie zostały transformowane nie wzrastają.

Jak się wizualizują różne formy RNA w żelu

W elektroforezie RNA na żelu możemy zobaczyć 2 prążki (2 podjednostki).

Plazmidy występują w 3 konformacjach:

• superskręconej (cccDNA)

• liniowej

• kolistej rozluźnionej 

wizualizacja wszystkich 3 form na żelu

W czasie elektroforezy superskręcona

migruje najszybciej, a kolista rozluźniona najwolniej. 

Ogólnie superskręcona jest najbardziej kox

w przypadku traktowania komórek lizą alkaliczną, liniowe i koliste DNA denaturuje, a superskręcone pozostaje niezmienione, w ten sposób możemy je oddzielić i oczyścić.

 Lepkie i tępe końce

Lepkie i tępe końce to końce fragmentów DNA powstających po przecięciu cząsteczki przez hydrolizy restrykcyjne.

lepkie końce

enzym przecina DNA w sposób asymetryczny, tworzą się jednoniciowe, wystające fragmenty, łatwo związywane przez ligazy.

tępe końce

enzym restrykcyjny przecina obie nici DNA w tym samym miejscu.

star activity

w warunkach nieoptymalnych dla enzymu można zaobserwować niespecyficzne wyniki hydrolizy, bo w tych warunkach enzym rozpoznaje także sekwencje różniące się od sekwencji, dla której jest specyficzny (różniące się np. o jedną zasadę).

Wizualizacja na żelu po restrykcji wektora

 Barwienie X-Gal - zasada działania

X-Gal (razem z IPTG) to syntetyczny substrat dla β-galaktozydazy w składzie pożywki LB do selekcji z ampicyliną. Jeśli gen kodujący β-galaktozydazę jest aktywny, to rozłoży on substrat X-Gal, a przez to kolonie bakteryjne przybiorą niebieską barwę. 

Jeśli komórka pobrała plazmid ze wstawką, to gen ten będzie niefunkcjonalny, X-Gal nie zostanie rozłożony i kolonie będą miały biały kolor.

operon laktozowy

 lacZ, koduje enzym β-galaktozydazę (laktazę), która rozkłada laktozę do glukozy i galaktozy. 

Po inkubacji na pożywce wyrastają kolonie. Kolonie niebieskie są puste (bez wstawki), a białe mają wstawkę (rozkładają laktozę).

operon laktozowy wykorzystuje się

do selekcji metodą blue-white screening (alfa-komplementacja) transformowanych bakterii. Wstawka (z wybranym przez nas genem) znajduje się w operonie LacZ. Na wektorze znajduje się N’-końcowy fragment LacZ kodujący β-galaktozydazę wraz z sekwencją promotorową. W genomie szczepi biorcy znajduje się część C’-końcowa z elementami niezbędnymi do ekspresji.

elektroporacja

jest metodą transferu DNA ze środowiska do komórek bakterii przy użyciu krótkich impulsów wysokiego napięcia elektrycznego, co prowadzi do przejściowej destabilizacji błon komórkowych i powstanie porów.

sonikacja

wykorzystuje ultradźwięki. Pękające mikropęcherzyki gazu uszkadzają błonę i umożliwiają wniknięcie DNA.

elektroporacja vs sonikacja

Elektroporacja jest zdecydowanie wydajniejszą metodą, ale wymagane jest usunięcie jonów (soli) z próbki i komórek. W sonikacji nie ma tego problemu, ale za to ultradźwięki mogą uszkodzić długie łańcuchy DNA w przypadku dużych plazmidów. 

transformacja

przekazanie cech genetycznych szczepom biorcy — z pominięciem łączenia w pary — za pomocą wolnego, rozpuszczalnego DNA uzyskanego od dawcy. 

[czyyyyli łopatologicznie komórka wchłania dupą podsunięty jej plazmid zawierający geny, które mu dodaliśmy]

transformacja przydatna jest do

• tworzenie bibliotek genomowych

• klonowanie molekularne

• sekwencjonowanie

• produkcja białek rekombinowanych

• badania oporności na antybiotyki

Narysować wektor

Projektowanie starterów

 Wady transformacji 

• problemy ze stabilnością genetyczną

• konieczność stosowania markerów selekcyjnych (antybiotyki)

Niebezpieczeństwa uwolnienia mutantów do środowiska

• horyzontalny transfer genów

• zaburzenie równowagi ekosystemu

• potencjalne ryzyko zdrowotne dla ludzi

 Sekwencje palindromowe

to sekwencja, która w obu kierunkach jest odczytywana tak samo, np.: 

5’-AGCT-3’

3’-TCGA-5’

tak jak w języku polskim słowo KAJAK albo KAMIL ŚLIMAK

Sposób sprawdzenia czy insert został poprawnie wbudowany (orientacja)

metoda z 2 enzymami restrykcyjnymi, 1 asymetrycznie wstawke a drugi gdzieś na plazmidzie, opisz ładnie

 Wirowanie w gradiencie chlorku cezu z bromkiem etydyny

jest metodą izolacji (oczyszczenia) DNA i RNA. 

Chlorek cezu służy jako

gradient stężeń. Bromek etydyny budową przypomina zasadę azotową, więc daje nam możliwość interkalacji, obciążając i zmieniając strukturę kwasu nukleinowego, co powoduje jego opadanie w roztworze chlorku cezu. RNA zbiera się na dnie probówki, a białka na górze. Zgodnie z gradientem stężeń według gęstości układają się także konformacje plazmidów.

DNA paramtery absorbancji

• A260/A280 — 1,7 - 1,9, odchylenia: degradacja DNA, zanieczyszczenie DNA odczynnikami organicznymi, zanieczyszczenie przez RNA

• A270 — zanieczyszczenie fenolem

• A230 — węglowodory, związki aromatyczne, etanol, polisacharydy, EDTA, zanieczyszczenie białkami

RNA paramtery absorbancji

A260

mieszanina fenol-chloroform-alhohol izoamylowy? Do czego służy?

Oczyszczanie i oddzielenie od białek

0.1ul ile to ml

ul - 10^-6
ml - 10^-3
0.1ul : 1000 = 0,0001ml 

enzymy 1 klasy wymagają:

Mg2+, SAM, ATP

Enzymy 2 klasy wymagają

Mg2+

Enzymy 3 klasy wymagają:

Mg2+, ATP

Klonowanie A/T to klonowanie na:

lepkie końce

Ile trzeba dodać NaOH do pożywki 10 ml 10M, gdzie NaOH= 40 g/mol?

4g

Składowe podłoża LB opisać,

• antybiotyk (ampicylina) - czynnik selekcyjny

• IPTG

• X-Gal

• betagalaktozydazy

IPTG

 induktor ekspresji genów kontrolowanych przez promotor lac

X-Gal

syntetyczny substrat, wykorzystywany do wykrywania aktywności

W elektroforezie małe cząsteczki migrują: 

szybciej niż większe cząsteczki

Etanol 96% do czego jest stosowany?

Wytrącenie kwasów nukleinowych 

Neoschizomery co to i 2 sekwencje,

Enzymy restrykcyjne izolowane z różnych bakterii rozpoznające identyczną sekwencji w DNA, ale wprowadzające odmienny typ cięcia.
GACGT/C
GAC/GTC

Co jest charakterystyczne w składzie T-wektora

Obecność wyłącznie jednego nukleotydu - tymidyne (dTTP), zamiast mieszaniny nukleotydów