PSP T2: Lisis

¿Dónde se puede localizar el producto?

• Intracelular

• Extracelular

Características si el producto es intracelular:

• Relativamente concentrado → fácil de concentrar, al separar la biomasa te quedas con 5x menos volumen

• Fácil separación del producto de contaminantes del medio

• Disrupción celular

• Contaminantes provenientes de la disrupción celular

Características si el producto es extracelular:

• Concentración variable (difícil de concentrar)

• Se requiere separación del producto y contaminantes del medio → separación sólido-líquido

• No disrupción celular

→ *Ha de ser estable en el medio de cultivo (dentro de la célula puede estar más protegido):

¿Puedes escoger si el producto es intracelular o extracelular? Da ejemplos de productos de ambos tipos:

No, viene dado por el producto y el huésped.

• Intracelular: vitaminas

• Extracelular: antibiótico y anticuerpos

¿Puede suceder que el producto sea originalmente intracelular pero que pase a ser extracelular?

Sí, puede que una parte del producto pase a ser extracelular, se considerarían pérdidas. Hay que considerar si vale la pena recuperar la porción extracelular o no.

¿Qué porcentaje de sólidos (producto) es aceptable en una solución?

Entre 30-40%, ya que se trabaja con bombas.

Para todas las técnicas que se van a explicara continuación, ¿qué se asume?

Que el producto es principalmente intracelular y que se separa la biomasa del resto.

¿Cuáles son los objetivos de la lisis?

• Eficiencia y reproducibilidad

• Maximizar la obtención del producto de interés en estado líquido, manteniendo su actividad biológica

• Minimizar la contaminación del producto con otros componentes celulares

• Limitar los posibles efectos negativos en las posteriores etapas de separación

¿Qué ocurre si la lisis es excesiva?

La disrupción es un proceso altamente estresante, si es excesiva puede provocar:

• Pérdida del producto

• Pérdida de la actividad biológica

¿Qué se prioriza en la lisis, rendimiento o pureza?

Se prioriza rendimiento para obtener una mayor cantidad de producto, ya que una disrupción selectiva es muy complicada. Otras unidades al final del proceso de downstream priorizarán la pureza.

¿Es importante saber que tipo de célula se está lisando?

Sí, ya que así se podrá encontrar la mejor manera de lisar la célula.

Características de la estructura celular de las procariotas:

• No tienen orgánulos internos: solo hay que romper la barrera

• Dos tipos

  • Archea: enzimas con estabilidad en condiciones extremas (pH, Tª…)

  • Eubacteria:

    • gram + (pared de peptidoglicano gruesa) → más resistencia

    • gram - (pared de peptidoglicano fina)

• Pared celular: rígida y no compresible

• Membrana celular:

  • Más esteroles → más rígida

  • Más proteínas → más flexible

Características de la estructura celular de las eucariotas:

• Tienen orgánulos internos

• Capacidad de secretar el producto al exterior

• Células de levadura y hongos: tienen pared celular compuesta por β-glucano y quitina, por lo que son rígidas

• Células de animales: muy frágiles (no tienen pared celular) → el problema no es lisarlas, sino que lleguen a esta etapa intactas porque muchas se dañan durante el proceso

• Células vegetales: tienen pared celular compuesta por celulosa, por lo que son rígidas, pero su gran tamaño hace que sean más frágiles que las levaduras y los hongos

Verdadero o falso: Dependiendo del producto que tengas, se escogerá un huésped u otro

Verdadero, hay cuatro tipos de huéspedes con sus ventajas y desventajas

¿Cómo se pueden clasificar las diferentes técnicas?

Según:

• La escala: lab-scale vs large-scale

• Condición: líquido vs sólido

• Principio:

  • No mecánicos o químicos

  • Mecánicos

Enumera

• Principio

• Estrés

• Coste

• Ejemplo

de este método químico:

Choque osmótico

• Principio: disrupción de la membrana por choque osmótico

• Estrés: bajo

• Coste: barato

• Ejemplo: disrupción de los glóbulos rojos

¿Por qué se considera un método químico?

Porque utiliza sales

¿Qué es la Osmolaridad (osM)?

Es el número de partículas por volumen

Qué le sucederá a la célula si se encuentra en un medio:

• Hipertónico

• Isotónico

• Hipotónico

• Hipertónico: hay más producto en el exterior, por lo que el agua sale y la célula se encoge

• Isotónico: igual concentración dentro que fuera, la célula queda igual

  • = 0,3 osM en bacterias

  • 0,9% de NaCl en suero fisiológico

• Hipotónico: hay menos producto en el exterior, por lo que el agua entra y la célula se hincha y revienta → LISIS

¿Qué permite conocer la ley de van’t Hoff?

Permite calcular la presión osmótica que se induce a la célula

Enumera

• Principio

• Estrés

• Coste

• Ejemplo

de este método químico:

Digestión enzimática

• Principio: digestión de la pared celular

• Estrés: bajo

• Coste: caro

• Ejemplo: tratamientos con lisozima e hidrolasas

¿Qué se utiliza para hacer la digestión de la pared celular?

Se utilizan enzimas que tengan actividad sobre la pared celular del huésped:

• Lisozima: hidrólisis de las uniones beta 1,4 entre los residuos de ácido N-acetilmurámico y N-acetil-D-glucosamina en un peptidoglicano (bacterias) → se pueden obtener de la clara de huevo

• Quitinasa: para hongos

• Otras hidrolasas (celulosa, hemicelulosa y pectina): capacidad de degradar los polisacáridos que constituyen la pared celular de los tejidos vegetales

Verdadero o falso: la técnica de digestión enzimática afecta al producto

Falso, la enzima está dirigida a romper la membrana, el producto no se daña

¿Por qué no se usa el método de digestión enzimática en la industria?

Es demasiado caro, el coste de la enzima es 10 veces más que el coste del producto.

Enumera

• Principio

• Estrés

• Coste

• Ejemplo

de este método químico:

Solubilización

• Principio: solubilización de la membrana con detergentes

• Estrés: bajo

• Coste: moderado

• Ejemplo: disrupción de E. coli con sales de bilis

¿Cómo se pueden encontrar las condiciones para la solubilización?

Haciendo prueba y error

¿Qué tipos de detergentes suelen ser los más usados? ¿Cuáles son sus características?

Los detergentes no iónicos → SDS, Triton X-100, n-dodecyl-β-D-maltoside, CHAPS

• Rompen proteína-lípido, lípido-lípido, pero no proteína-proteína

• Se usan para separar proteínas de membrana

• Inducen poca desnaturalización de las proteínas

• Se pueden usar en cultivos de células animales (0,1%-0,3% de Triton X-100)

• El detergente acaba siendo un contaminante, hay que ser capaz de separarlo

• Puede inducir generación de espumas → la espuma puede dificultar mucho procesos posteriores, por ello es un método poco común

Enumera

• Principio

• Estrés

• Coste

• Ejemplo

de este método químico:

Disolución de lípidos

• Principio: disolución de la membrana mediante solventes orgánicos

• Estrés: moderado

• Coste: barato

• Ejemplo: disrupción de la levadura con tolueno

La acetona (solvente orgánico), aparte de lisar, también…

Precipita

¿Cuáles son los problemas con el uso de solventes orgánicos?

• Tóxicos

• Volátiles

• Inflamables

• Desnaturalizan proteínas → el solvente por excelencia es el agua, muchos productos tienen actividad en agua y no en solventes orgánicos

• Necesitan ser separados del producto

Verdadero o falso: se pueden utilizar solventes orgánicos cuando el producto son antibióticos o enzimas biológicas

Falso, las enzimas se desnaturalizarían. Solo se pueden usar para productos que sean estables en estos.

Verdadero o falso: los solventes orgánicos se pueden usar para hacer lisis y extracción líquido-líquido

Verdadero

¿Qué se necesita para escalar el proceso de lab a planta con solventes orgánicos?

Controlar los solventes orgánicos a nivel de laboratorio es fácil, pero en planta hay que cumplir una regulación específica para trabajar con material explosivo (planta ATEX) → es muy caro

Enumera

• Principio

• Estrés

• Coste

• Ejemplo

de este método químico:

Tratamiento alcalino

• Principio: saponificación de los lípidos de la membrana

• Estrés: alto (pH muy básico)

• Coste: barato

• Ejemplo: extracción de ácidos nucleicos

Verdadero o falso: el tratamiento con sosa (NaOH: base fuerte) es muy barato y efectivo para la lisis, pero se pierde actividad biológica

Verdadero

Nombra todos los métodos de lisis químicos estudiados:

• Choque osmótico

• Digestión enzimática

• Solubilización

• Disolución de lípidos

• Tratamiento alcalino

Enumera

• Principio

• Estrés

• Coste

• Ejemplo

de este método físico:

Homogeneizadores (tipo mortero)

• Principio: las células colisionan contra una superficie rígida, provocando la ruptura por fuerzas de cizalla y el grinding effect

• Estrés: moderado

• Coste: moderado

• Ejemplo: ruptura de tejidos animales

Verdadero o falso: el sistema más sencillo es un mortero (recipiente + émbolo), donde las células se rompen por el golpe de mortero

Falso, las células no se rompen por el golpe en sí, sino por la fricción con el mortero (grinding effect)

****PREGUNTAR: 10-100 um de espacio entre mortero y vara

solo funciona con células animales????

Verdadero o falso: el mortero induce la ruptura de la membrana celular y la de los orgánulos en células animales

Falso, no es capaz de romper la membrana de los orgánulos

Enumera

• Principio

• Estrés

• Coste

• Ejemplo

de este método físico:

Ultrasonidos (sonicador)

• Principio: las células se rompen debido a las cavitaciones sónicas

• Estrés: alto

• Coste: caro

• Ejemplo: suspensiones celulares a pequeña escala

¿Cómo funciona un sonicador?

Es una sonda que vibra, pudiendo variar la amplitud y la intensidad de la vibración. La sonda se mueve como un péndulo y genera dos ciclos, uno de baja presión y otro de alta. Cuando la presión es baja, se generan burbujas, y cuando sube la presión, las burbujas colapsan (cavitación). Esto genera unas ondas de choque que se propagan, causando que las células se rompan.

Define que son las cavitaciones sónicas:

Son energía mecánica en forma de ondas de choque que se generan cuando burbujas generadas por vibraciones a alta frecuencia se colapsan e implosionan.

¿Cuántos segundos son necesarios para muestras pequeñas para inducir una ruptura mediante sonicador?

Entre 30 y 60 segundos

Enumera

• Principio

• Estrés

• Coste

• Ejemplo

de este método físico:

Recámara a alta presión

• Principio: las células se rompen debido a las fuerzas de cizalla al pasar por un orificio pequeño

• Estrés: alto

• Coste: moderado

• Ejemplo: suspensiones celulares a gran escala

Explica el funcionamiento del French Press (recámara a alta presión a escala de laboratorio):

Tiene una cámara cerrada con pistón que permite hacer mucha presión (aprox 1000 bars). Induce la lisis celular por presión cuando el pistón baja, haciendo que las células pasen a una alta velocidad por un orificio pequeño e impacten contra una superficie dura. Se utiliza a nivel industrial para romper bacterias.

¿Cuántos pases son necesarios para inducir la lisis en un French Press?

Dos pases, ya que el primero debilita mientras que el segundo provoca la ruptura.

¿Qué desventajas tiene el French Press?

• El movimiento del pistón genera mucha energía térmica que puede causar que el producto pierda energía actividad biológica, por lo que se necesita un sistema de refrigeración

• No opera en continuo → se trabaja en batch (en lots), pero el volumen de trabajo no es muy alto por lo que se puede pasar la solución varias veces para aumentar la eficiencia de lisis

  • No opera en continuo

  • No adaptado a grandes volúmenes

Explica el funcionamiento del homogeneizador Maton-Gaulin tipo válvula (recámara a alta presión a gran escala):

La solución entra y pasa por una válvula en la recámara (D) que permite su paso a la cámara de disrupción (E), una vez pasa la solución la válvula se cierra. En la cámara de disrupción hay unas placas donde se genera el impacto por el émbolo (C), el cual puede modificarse la presión aplicada. Una vez se hayan lisado las células, se abre la válvula de salida y sale la solución. Es un sistema pseudocontinuo.

¿Cuáles son las características del homogeneizador Maton-Gaulin tipo válvula?

• Las muestras son introducidas a pulsos

• Tiene posibilidad de varios pases

• Tiene diferentes configuraciones de la recámara

• Su ecuación es empírica

¿De qué depende la constante de lisis (k)?

Depende de la temperatura, de la geometría de la recámara, del tipo de suspensión (como es el huésped), de como se ha generado la célula (si se ha generado con un alto estrés mecánico tendrá más resistencia), de la concentración, etc.

¿Qué cultivo tendrá mayor Kl, uno continuo o uno batch?

• En un cultivo continuo (como un quimiostato), las células pueden mantenerse en un estado de crecimiento activo y constante con una tasa de crecimiento (μ) elevada. Las células que crecen más rápido suelen tener paredes celulares menos robustas o más delgadas, lo que las hace más susceptibles a la rotura.

• En un cultivo batch, la tasa de crecimiento varía a lo largo del tiempo (fases lag, exponencial y estacionaria). Normalmente, la cosecha se realiza cuando la tasa de crecimiento ha disminuido o las células han entrado en fase estacionaria, momento en el que las paredes celulares suelen volverse más rígidas y resistentes, resultando en una menor constante de lisis.

¿De qué depende a?

Del tipo de suspensión/célula

¿Qué tipo de válvulas puede tener un homogeneizador Maton-Gaulin tipo válvula?

• Standard valve → más común

• Cell-rupture valve

• Grooved valve

• Knife-edge valve → más común

• Conical valve

• Ball cell disruption valve

¿Cómo funciona el homogeneizador de microfluidos (recámara a alta presión a gran escala)?

Se pone la solución en un reservorio termocontrolado, la cual es impulsada por un turbo bomba, que ejerce una presión de aproximadamente 2000 bars. La solución llega a una cámara de interacción de geometría fija, donde el diámetro decrece, provocando que aumente tanto la velocidad como el calor. Las células impactan contra las paredes de la cámara (90º), resultando en su ruptura.

Verdadero o falso: todos los pases en un homogeneizador de microfluidos no son igual de eficientes

Verdadero

¿De qué depende el parámetro b?

Del tipo de célula: nativa vs recombinante → las células recombinantes son un poco más sensibles

Verdadero o falso: una gram - necesita menos presión para romperse que una gram +

Verdadero

Verdadero o falso: se necesita menos presión para lisar una levadura que una bacteria

Falso, se necesita más presión para lisar una levadura debido a la pared de quitina

Si se aplica la presión indicada en la columna, ¿qué porcentaje de lisis se inducirá?

R = 0,5

Enumera

• Principio

• Estrés

• Coste

• Ejemplo

de este método físico:

Molino de bolas (gran escala)

• Principio: las células se rompen al colisionar contra partículas abrasivas (bolas de cristal o acero)

• Estrés: alto

• Coste: barato

• Ejemplo: suspensiones celulares a gran escala

¿De qué material suelen ser las bolas del molino?

De vidrio o metal (material inerte)

¿Cómo se lisan las células en un molino de bolas?

La disrupción no se induce por choque, sino por efecto abrasivo, las bolas se chocan y se rozan entre ellas generando tensión y rompiendo las células (“grinding effect”).

El molino de bolas genera mucha calor (debido al grinding effect), ¿cómo se gestiona?

• Se puede introducir un sistema de intercambio calor externo al tambor para que no se sobre caliente

• Se puede añadir glicerol frío

• Se puede añadir nitrógeno líquido: si se congela la muestra no pasa nada, ya que así se consigue más disrupción. Tampoco hay que preocuparse de separarlo, ya que si se calienta se evapora en forma de N2.

Verdadero o falso: se necesita más tiempo de residencia para lisar levaduras y hongos que bacterias en un molino de bolas

Falso, cuesta más tiempo romper bacterias, ya que son muy pequeñas por lo que su resistencia mecánica es mayor. En cambio, las levaduras y los hongos tienen células más grandes, por lo que cuesta menos romperlas.

¿Qué parámetros son importantes en la elección de un método de disrupción?

• La susceptibilidad de las células a romperse

• La estabilidad del producto (número de pases, Tª…)

• La facilidad de separación entre el producto y contaminantes (restos celulares) → la centrifugación no suele estar bien diseñada para separar bien el debris celular, la única unidad que te asegura una buena separación es la microfiltración

• Velocidad, capacidad y eficiencia del método → cuánto tiempo quieres que dure la disrupción?

  • 30 minutos: demasiado rápido, el equipo tiene más capacidad de la que estas utilizando

  • 8 horas: demasiado lento, el equipo está infradimensionado

  • 2-3 horas: bien

• El coste

¿El tiempo óptimo de una lisis es cuando R = 100%?

No, ya que habría una pérdida de actividad