Microbiologia-bactérias (salomé)

MED VET-ICBAS

funções dos corantes

aumenta a visibilidade

acentuam características morfológicas

permitem a preservação de amostras

o que é fixação e quais os tipos

processo pelo qual os organismos são mortos e firmemente ligados à lâmina de vidro para preservar estruturas internas e externas

fixação pelo calor→ preserva a morfologia geral, mas não as estruturas internas

fixação química→ protege as estruturas subcelulares e a morfologia geral em organismos mais delicados

colorações simples

azul de metileno→ organismos ficam azuis

cristal violeta→ organismos ficam roxos/violetas

fucsina de carbol→ organismos ficam vermelhos

colorações diferenciais-gram

• coloração gram = violeta cristal(roxo)+ lugol(fixador)+álcool(descolorante= acetona ou etanol)+ safranina(vermelho)

gram positivas → parede espessa de peptidoglicano→ o álcool não consegue despigmentar→ ficam roxas

ex: Staphylococcus aureus

gram negativas→ parede de peptidoglicanos fina com membrana externa→ álcool dissolve a membrana externa (lípidos)e descolora o organismo→ absorve a safranina depois

ex: Escherichia coli

colorações diferenciais- álcool ácido resistentes ( ziehl-neelsen)

coloração de ziehl- neelsen = fucsina a quente+arrefecimento e lavagem+ álcool ácido+ azul de metileno

fucsina+ calor→ derrete a camada de cera e cora a vermelho, após o arrefecimento a cera endurece e a fucsina está presa dentro

organismos álcool ácido resistentes→ a cera resiste ao efeito do descolorante álcool+ ácido clorídrico, logo mantem o vermelho da fucsina

ex: Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium leprae →

organismos não álcool ácido resistentes→ quando o organismos tem pouca cera é descolorado, e absorve posteriormente o azul

coloração estrutural- endósporo ou schaeffer fulton

coloração endósporo= verde de malaquite a quente+ lavagem com água+ safranina

calor força entrada do verde malaquite

organismos com endósporo→ mantém o verde

ex: clostridium

organismos sem endósporo→ perdem a cor na lavagem e coram com safranina (ros/vermelho)

formas básicas

exemplos espiroquetas

flexíveis= espiroquetas

rígidos= espirilos

exemplo vibrião

forma de vírgula

o que determina a forma da bactéria

a parede celular

agrupamento de bacilos

obtido por divisão

agrupamento de cocos

obtido por divisão

*tétradas

características das bactérias gram negativas e gram positivas

de fora para dent

• gram positiva

→ parede de peptidoglicano espessa

→ ácidos teicoicos e lipoteicoicos→ polímeros que atravessam a camada de peptidoglicano→ ancoram a bactéria a célula hospedeira→ fator de virulência

→ espaço periplasmático pequeno

→ membrana plasmática interna

• gram negativa

→lipopolissacarídeos→ possui carga negativa; estabiliza a parede; resite aos sais biliares; antigénio O(escape do sist imune); endotoxina

→membrana externa com porinas

→parede de peptidoglicano fina

→espaço periplasmático amplo

→membrana plasmática interna

estrutura das micobactérias

de dentro para fora

1- membrana plasmática interna

2-camada de peptidoglicano

3-camada arabinogalactano→ LAM→ bloqueia a ataques e desativa vias de comunicação das células de defesa

4-camada de ácidos micólicos (cera)

5-lípidos superficiais e porinas

importância da parede celular bacteriana

• responsável pela forma da célula

  • protoplasto→ distituida de parede

  • esferoplasto→ alguns resíduos de parede

determina o comportamento gram

protege a célula de lise osmótica

pode contribuir para patogenicidade

pode proteger de substâncias tóxicas

estrutura do peptidoglicano

cadeias lineares e longas formados pela alternância de 2 açúcares:

NAG→ N-acetilglicosamina

NAM→ Ácido N-acetilmurâmico

essas cadeias são unidas por pontes de cadeias peptídicas (aminoácidos) cruzadas entre os açúcares NAM (cada Nam tem uma cadeia que se unem no meio do caminho)

subunidade básica do peptidoglicano (imagem)

procariotas sem peptidoglicano

• mycoplasma→ não tem parede, são pleumorficas→ incapazes de sintetizar paptidoglicano→ resistentes a penicilina→ tem colesterol obtido do organismo que infetam

• Archea→ parede pode ser constituida por proteínas, glicoproteínas ou polissacáridos→ pseudoglicanos

relações entre micobactérias/ gram positivas/ gram negativas

estabilizadores da membrana citoplasmática em eubactérias

como as eubactérias não sintetizam colesterol, usam hopanoides para substituir, aumentando a fluides da membrana

exceto o mycoplasma que não tem parede celular e pode incorporar colesterol na membrana se roubar ao hospedeiro

composição da membrana citoplasmática

• bactérias→ composta por bicamada de fosfolípidos

  • ligação ÉSTER (C-O=C)entre o hidrocarbonetos e o L-glicerol

  • ligações covalentes entre as moléculas de cada linha da bicamada

  • cadeias de ácidos gordos lineares e sem ramificações

• Archea→ composta por uma monocamada lipídica

  • ligação ÉTER(C-O-C) entre os hidrocarbonetos e o D-glicerol

  • não possui ácidos gordos e sim cadeias ramificadas de isopreno com ou sem anéis

  • os isoprenos de cada lado se fundem, formando uma cadeia contínua→ monocamada

funções da membrana plasmática

cápsula bacteriana

é um fator de virulência

protege contra agentes do sistema imune, fazendo com que não reconheça a bactéria como um agente estranho

contituída por polissacarídeos, podendo ser mista

o que são Biofilmes

comunidades estruturadas de microrganismos (como bactérias ou fungos) que crescem aderidos a uma superfície(biótica ou abiótica) e que estão envolvidos por uma matriz protetora auto-produzida, constituída por polissacaríeos

formação dos biofilmes

1- adesão inicial de bactérias livres em uma superfície biótica ou abiótica

2-produção de polissacarídeos que fazem a fixação irreversível

3-proliferação das bactérias iniciais e incorporação de outras

4-maturação:

• diferenciação metabólica

• quorum-sensing→ sist de comunicação química usado para monitorizar a densidade da população e coordenar seu comportamento coletivo

• transferência de genes

5- formação de um biofilmes que protege as bactérias dos agentes biocidas e do sistema imune

6- pedaços podem desprender-se ou liberta-se uma grande quantidade de novas bactérias livres→ fator de virulência → infeções persistentes e resistêntes

todos os invólucros externos à parede celular

• glicocálice

• cápsula

• slime layers→ formador de biofilme

• s-layers→ estrutura formada por proteína que pode substituir a parede nas archaea

outras estruturas que promovem adesão

Fímbrias ou pili:

3-10 nm de espessura com vários μm de comprimento

não são para locomoção

podem conjugar-se e ser ponde de comunicação entre bactérias

classifique os flagelos da imagem

São estruturas de locomoção que podem apresentar várias formas e quantidades

1- monotríquio

2- anfitríquio

3- lofotríquio

4-peritríquio

estruturas de um flagelo

1-filamento feito de flagelina

2-gancho

3-corpo basal→motor rotativo ancorado na parede celular, funciona similar a ATPase

4-Anéis→ gram negativas têm 4 e gram positivas têm 2

5- proteínas mot→ geram torque e fluxo de protões

6- proteínas fili→ funcionam como interuptor que dita o sentido da rotação.

rotação para esquerda → locomoção para frente

rotação para direita→ não saem do síto, só movimentação aleatória

se houver mais de um flagelo, todos giram no mesmo sentido

como funciona a ativação dos flagelos

por quimiotaxia bacteriana

recetores detetam a presença de substâncias químicas no ambiente, atrativas ou repelentes

através da via de comunicação cheA/cheY

constituintes da matriz citoplasmática

• nucleóide

  • não existe invólucro nuclear

  • 60% DNA circular (plasmídeos) + RNA + proteínas (não são histonas)

• inclusões ou corpos de inclusão: são grânulos de armazenamento de lípidos, polissacarídeos, polifosfatos, enxofre, páptidos ou magnetossomas

• vesículas (vacúolos) de gás constituídos por proteínas→ cianobactérias

Esporos

em microbiologia não são estruturas reprodutivas, são uma camada protetora em condições desfavoráveis

→ cada bactéria da origem a um só esporo

→ é um estado alternativo de vida bacteriana→ latência e sem atividade metabolica

→ forma resistente a condições adversas:

• cálcio complexado com ácido dipicolínico

• proteínas que protegem o DNA(SASPs)

• centro desidratado

• invólucro espesso

→ formação de esporos é característica de um grupo de bactérias do filo firmicutes, que inclui Bacillus e clostridium

organização esporos bacterianos

• esporo a verde na imagem

  • forma oval ou redondo

  • central, sub-terminal ou terminal

• esporngeo a bege na imagem

  • aumentado ou não

processo de esporulação

por invaginação da membrana plasmática→ fissão→ maturação→ libertação

como ocorre o crescimento bacteriano

por fissão binária→ cada bactéria da origem a duas→ crescimento exponencial em condições ótimas

Nt=N0 × 2^n <=> n= [log(Nt) - log(N0)] /log2

n= número de gerações

Quantificação de bactérias

• direta (total)

Câmara de neubauer→ lâmina de vidro especial com um xadrez microscópio gravado a laser para contar por quadrantes

contador de partículas→equipamento eletrónico automatizado, contagem por interferencia na corrente elétrica

• viáveis (vivas)

plaqueamento de diluições seriadas→ UFC/mL = (nº de colónias)/(volume inicial x fator de diluição)

filtração de membranas→ quando há poucas bactérias filtra-se em uma memb com poros pequenas e dps inoculamos

fases do crescimento em recipiente fechado

1- síntese de novos componentes→ adaptação à nova cultura

2- taxa de crescimento constante→ normalmente exponencial

3- fase estacionária→ células viáveis e metabolicamente ativas, mas sem replicação ou morte

→ formação de esporos entre fases ←

4- fase morte→ escassez de nutrientes, acumulo de subs. inibidoras→ decaimento exponencial com danos irreversíveis

quorum sensing

quimiotaxia bacteriana:

comunicação e cooperação entre bactérias, envolvendo secreção e deteção de sinais químicos, provocando alterações na expressão genética

crescimento de microrganismos em cultura contínua

crescimento em sistema aberto com reposição de nutrientes e remoção de desperdícios→ mantém as bactérias em crescimento exponencial durante longos períodos

ex: quimiostato→ velocidade de entrada de meio fresco= velocidade de remoção do meio

fatores que afetam o crescimento bacteriano

• temperatura

• oxigénio

• disponibilidade de água

• pH

• pressão

• radiação

classificação das bactérias de acordo com sua temperatura ótima de crescimento

• psicrófilas→ <15ºC

• psicrotróficas/psicrotolerantes→ 20ºC a 30ºC

• mesófilas→ 25ºC a 40ºC

• termófilas→ 50ºC a 60ºC

• hipertermófilas→ >80ºC

classificação das bactérias de acordo com a afinidade com O2

• aeróbias obrigatórias→ necessitam obrigatoriamente de O2→ crescem somente próximo a superfície do tubo

• anaeróbias facultativas→ crescem melhor e mais rápido na presença de O2, mas conseguem continuar a crescem sem ele→ são as mais adaptáveis→ crescem em maior quantidade na superfície, mas estão por todo o tubo

• aerotolerantes→ metabolismo estritamente anaeróbio, mas não morrem na presença de O2→ espalhadas uniformemente no tubo

• anaeróbias estritas→ O2 é tóxico→ estão somente na base do tubo

• microaerófilas→ precisam de oxigénio em quantidades muito baixas→ fica próximo a superfície do tubo, mas não o mais próximo possível

porque muitos microrganismos tem sensibilidades ao O2

o O2 é facilmente reduzido a produtos tóxicos

• superóxido

• peróxido de hidrogénio

• radical hidroxilo

microrganismos que utilizam do O 2 possuem mecanismos de desintoxicação: enzima catalase

microrganismos adaptados a baixa disponibilidade de água livre

• halófilos

necessitam obrigatoriamente de NaCl para crescer→ Na+ estabiliza a estrutura

• osmo-tolerantes

não precisam de concentrações elevadas de soluto para viver, mas conseguem tolerar e crescer em ambientes com alta pressão osmótica

para evitar a plasmólise(murchar)→ célula produz solutos compatíveis para equilibrar a pressão osmótica

solutos compatíveis: K+( mais comum), açúcares, glicerol, aminoácidos e outros produtos

classificação das bactérias de acordo com o pH do meio

zonas de crescimento ótimo:

acidófilos→ pH o a 5,5

neutrófilos→ pH 5,5 a 8

alcalófilos→ 8,5 a 11,5

classificação das bactérias com a pressão elevada no meio

barotolerantes→ são afetadas negativamente, mas não gravemente

barofílicos→ precisam ou crescem mais rapidamente

efeitos da radiação as bactérias

raios gama→ radiação ionizante→ lesões do DNA→ mutagénese

raios x→ lesões do DNA→ mutagénese

UV→ radicais tóxicos→ oxigénio singleto

métodos de conservação e esterilização

• conservação

  • frio

  • desidratação

  • agentes osmóticos

  • conservantes químicos

• esterilização

  • calor: seco ou húmido

  • radiações: raios gama, raios x ou UV

  • filtração

  • agentes químicos

classifique as bactérias segundo as suas fontes de energia

• fototróficos: luz solar→ energia química

• quimiotróficos (transferência de eletrões):

  • quimioheterotróficos/ quimioorganotróficos: compostos orgânicos reduzidos→ compostos inorgânicos oxidados

  • quimiolitiotróficos: compostos inorgânicos reduzido→ compostos inorgânicos oxidados

• autotróficos: CO2→ compostos inorgânicos

• heterotróficos: compostos orgânicos→ energia

Transporte de nutrientes

todos os tipos de transporte→ passivo, facilitado e ativo

2 em especial:

• transportadores ABC( ATP-binding cassete)

• transporte PEP-PTS( com translocação de grupo)→ exclusivo de procariotas

transportadores ABC( ATP-binding cassete)

• transporte ativo primário que usa energia direta da hidrólise do ATP para bombear nutrientes para dentro, mesmo contra o gradiente de concentração→ açúcares aminoácidos e iões

• proteína de ligação ao substrato: em gram negativas ligam-se no espaço periplasmático e gram positivas ancoram à face externa da membra

• domínio transmembranar (poro): 2 proteínas integrais formam o canal

• domínio citoplasmático(cassete): duas proteínas na face interna hidrolizam o ATP

transporte PEP-PTS

transporte por translocação de grupo

• PEP= fosfoenolpiruvato→ fonte de energia dadora do grupo fosfato (grupo P)

1-no citoplasma, PEP doa grupo P a enzima EI→ piruvato

2-EI transfere o grupo P → Hpr transfere → EIIA transfere→ EIIB ativa EIIC(poro membranar)→ glicose/manitol no exterior liga-se a EIIC→ glicose/manitol entra já fosforilado

catabolismo

processo de quebra de moléculas para gerar energia ATP

1- degradação extracelular com exoenzimas→ digestão de macromoléculas→ micromoléculas resultantes são transportados pra dentro

2- glicólise: glicose + NAD+→ 2 piruvatos + 2 ATP+2NADH + H+

3- ciclo de krebs e cadeia respiratória: oxidação do piruvato→ 34ATP+ 8NADH+ 2FADH

*cadeia respiratória cria o NAD+ que será usado na glicólise

fermentação

na ausência de cadeia respiratória, NAD+ pode ser obtido por fermentação

• lática: 2piruvato + 2NADH→ 2ácido lático + 2NADH + 2ATP

• alcoolica: 2piruvato - 2CO2→ 2acetaldeído + 2NADH + 2H+→ 2álcool etílico + 2NAD+

NAD+ vão para glicólise

agentes antibacterianos

compostos químicos usados para tratar infeções provocadas por bactérias. podem matar ou inibe o seu crescimento

antibióticos ou derivados

Paul Ehrlich

bala mágica

→ criador dos corantes químicos que pintavam exclusivamente um tipo de bactéria

→ logo, era possível criar um composto químico que matasse especificamente o microrganismo patogénico

Sahachiro Hato

→salvarsan: primeiro antimicrobiano para sífilis

*estudo juntamente com Paul Ehrlich

Gerhard Domagk, jacques e Teherese Trefouel

descobriram as sulfonamidas→ primeiro antimicrobiotico sintéticos de largo espetro → trava a produção de ácido fólico(essencial para bactérias)

penicilina

descoberta acidental por alexander fleming

eficácia demonstrado por Florey, Chain e Heatley

determinação da suscetibilidade de uma bactéria a um antibiítico

MIC( concentração mínima inibitória): a que concentração a bactéria para de se multiplicar

• vários isolamentos com diferentes concentrações progressivas de antibiótico, todas a partir de uma mesma origem

• a concentração mais baixa sem proliferação é a MIC

• método E-test→ tiras com quantidade crescentes de antibiótico

• método kirby-bauer→ discos de antibióticos

MBC( concentração bactericida mínima): a que concentração as bactérias foram efetivamente eliminadas

• seleciona-se os teste de MIC sem crescimento visível e fazer uma nova incubação com cada um deles

• a concentração mais baixa que apresentar uma ausência total ou redução de 99,9% de bactérias é a MBC

características importantes de quimioterápico

• toxicidade seletiva

• espectro de ação

• capacidade de chegar até os locais de infeção

• metabolismo no hospedeiro

• duração do tratamento

• interação com outros fármacos

mecanismos de ação antibióticos→ cicloserina

• cicloserina→ inibidores de peptidoglicano

  • produzia por Streptomyces

  • ocorre dentro do citoplasma

  • inibidor competitivo das enzimas D- alanina racemase e D-alanil-D-alanina sintetase→ NAG não consegue se ligar ao NAM

  • espectro de ação reduzido→ não é um antibiótico de primeira escolha

mecanismos de ação antibióticos→ bacitracina

• bacitracina→ inibidor de peptidoglicano

  • produzida por Bacillus

  • espectro de ação reduzido: só gram positivas e Neisseria

  • usado em aplicação tópica

  • NAG e NAM sintetizados no citoplasma e precisa sair para juntar à parede → liga-se ao transportador bactoprenol (molécula transportadora do monómero)→ inibe a ação do transportador

mecanismos de ação antibióticos→ vancomicina

• vancomicina→ inibidor de peptidoglicano

  • produzido por Streptomyces

  • espectro de ação reduzido: só gram positivas e Neisseria

  • usado para tratar infeções pro Sterptococcus, Staphylococcus e Clostridium

  • molécula muito grande, não passa a membrana

  • causa um impedimento estérico ao se ligar ao D-alanil-D-alanina na ponta do percursor do peptidoglicano→ inibidor de D-Ala-D-Ala

mecanismos de ação antibióticos→ beta- lactâmicos

• Penicilina e Cefalosporina→ possuem um anel de 4 carbosnos( beta-lactâmico)

  • anel beta- lactâmico liga-se às enzimas transpeptidases que estão na face externa da membrana→ inativa permanentemente a enzima→ impede que essa enzima faça a ligação dos monómeros vizinhos

  • ambas são destruídas por beta- lactamases que é um mecanismo de resitência das bactérias

  • penicilina atua em gram +→ não atravessa memb. ext das gram -

  • penicilina G via intravenosa ou intramuscular→ destruida no ácido do estômago→IV maior concentração no sangue, mas dura menos tempo/ IM (bezetacil) liberta mais lentamente, menos concentração no sangue, dura mais tempo

outros inibidores de peptidoglicano na família das penicilinas

• penicilina G é a original→ destruída por via oral e pelas beta-lactamases, não afeta gram -

• penicilina V→ +estável no estómago→ 1ª para via oral

• ampicilina→ atravessa a memb. externa das gram - e ativa em via oral

• carbenicilina→ oral e espectro alargado nas gram -

• meticilina→ resistente às beta-lactamases através de impedimento estérico que protege o anel, mas menos ativa que a penicilina G

• ticarcilina→ anti pseudomonas (bactérias com alta resistencia por beta-lactamicos) e mais ativa

outros inibidores de peptidoglicano na família das cefalosporinas

1ª geração

• atividade excelente conta gram +, mas pouca para gram -; suscetível a beta- lactamases

2ª geração

• impedimento estérico que resiste às beta-lactamases; espectro expande para cobri gram -

3ª geração

• aumentam muito a afinidade com gram - ao poder passar pelas porinas da memb. externa

outrso mecanismos de ação antibiótica→ inibição de sintese proteica

• inibidores de síntese proteica→ ataque aos ribossomas

  • aminoglicosídeos (amicacina, canamicina neomicina)→ ligam-se a subunidade 30S→ erro de leitura do mRNA→ proteínas defeituosas que destroem a própria membrana

  • tetraciclinas( doxiciclina e clorotetraciclina)→ primeiro antibiótico com largo espectro de ação com o mesmo mecanismo anterior

    • ligam-se ao cálcio, o que diminui a sua atividade e induz descalcificação

    • muito usado na pecuária como promotores de crescimento→ promove a resistência cruzada

  • clorofenicol→ liga-se a 50S e bloqueia a síntese→ elevada toxicidade (pouco usado)

  • macrólidos(eritromicina, calritromicina, azitromicina)→ atingem elevadas concentrações dentro da células eucariotas→ para infeções intracelulares como a Legionella pneumophila

mecanismos de resistência bacteriana

• bombas de efluxo:

  • sistema de ejeção ativa→ bombeiam antibióticos para fora ativamente antes que consigam atingir seu alvo→ eritromicina e tetraciclinas(ação citoplasmática)

  • existem vários tipos de bombas pertencentes a famílias diferentes

• impermeabilidade

• extrusão

• inativação

• alteração do alvo

• uso de vias alternativas

antibacterianos sintéticos

• Sulfanamidas (sulfametoxazol, trimetropim, dapsone)→ bloqueia produção de ácido fólico por mimetismo da PABA→ essencial para produção de DNA

  • principal mecanismo de resitência: vias alternativas para obter o ácido fólico

• Quinolonas ( ciprofloxacina, levofloxacina, moxifloxacina)→atacam diretamente os ácidos nucleicos, inibindo as enzimas DNA girase e Topoisomerase→ impede desenrolamento do DNA na replicação

  • largo espectro de atividade, baixas taxas de resistência, muito usado em med e vet

  • principais mecanismos de resistência: bombas de efluxo e alteração de alvo

origem dos genes de resitência

• genes cromossómicos

  • mutações, geralmente no alvo do antibiótico

• plasmídeos

  • podem ser transferidos entre bactérias diferentes

  • podem transmitir vários genes de resistência

*em determinados casos a resistência é reversível

tipos de transferência horizontal de genes

• transformação→ DNA livre é incorporado por uma bactéria competente→ o DNA livre vem de outra bactéria que sofreu lise

• transdução→ DNA é transferido mediante um vírus bacteriófago→ erro onde o vírus introduz DNA bacteriano na sua replicação→ ao infetar novas bactérias transmite os genes da antiga hospedeira

  • generalizada→ fagos virulentos→ DNA tranferido de qualquer região

  • especializada→ fagos temperados→ DNA transferido localiza-se no local de incerção do profago

• conjugação→ através do pili sexual há transferencia de DNA

  • bactéria dador (F+) estende o pili até a recetora(F-)→ o pili puxa a bactéria e forma uma ponte citoplasmática→ uma das cadeias de um plasmídeo é cortada e passa para a F- → F- sintetiza a cadeia e passam a ser ambas F+

  • reversível em alguns casos

ciclo dos bacteriófagos

• ciclo lítico→ multiplicação e destruição

1-fixação/adsorção em recetores específicos na parede

2-injeção/penetração do seu material genético (DNA ou RNA) no citoplasma, deixando a cápside fora vazia

3-replicação e transcrição/biossintese→ DNA/RNA do vírus destrói o da bactéria e obriga os ribossomas bacterianos a fabricar proteínas virais e duplicar o seu material genético

4-montagem/maturação→ novas cabeças e caudas dos vírus são montadas e empacotam o DNA duplicado→ vírus temperado

5-lise/libertação→ destruição parcial da parede→ morte bacteriana

• ciclo lisogénico→ vírus temperado infeta, mas não destrói

1 e 2 igual

3- integração/formação do profago→ DNA vírus integra-se diretamente no cromossoma

4-replicação→ fissão binária com transmissão do DNA viral

5-indução→ ao detetar perigo(stress ambiental) o profago solta-se do cromossoma bacterianos e entra em ciclo lítico