Flashcards Biotechnologie en Genetica (Video-notities)

Wat betekent DNA?

Desoxyribonucleïnezuur; drager van genetische informatie in cellen.

Wat betekent RNA?

Ribonucleïnezuur; enkelstrengig nucleïnezuur dat betrokken is bij transcriptie en eiwitsynthese.

Wat is cDNA?

Copy DNA verkregen door reverse transcriptie uit mRNA; introns meestal verwijderd.

Wat doet PCR (polymerase chain reaction)?

Amplificatie van dsDNA via drie fasen: initiatie, annealing en elongatie; meerdere cycli.

Wat is qPCR?

Kwantitatieve PCR die real-time de amplificatie meet en Ct-waarden oplevert.

Wat is ddPCR?

Digitale droplet PCR; DNA verdeeld in duizenden druppels voor absolute kwantificatie (Poisson-distributie).

Wat is Sanger sequencing?

Eerst generatie sequentieermethode met didesoxynucleotiden; capillaire gelelektroforese en fluorescent labels.

Wat is Illumina sequencing?

NGS-methode met reversibel terminatie; DNA wordt gebonden aan een flowcell en gesequenced na clustervorming.

Wat is TOPO cloning?

Kloonmethode op basis van Topoisomerase I die insertie vereenvoudigt; vaak met CCCTT-uiteinde.

Wat is Gateway cloning?

Kloonmethode gebaseerd op recombinatie met att-sites (attP/attB/attL/attR); BP- en LR-reactions met ccdB-selectie.

Wat is Gibson Assembly?

One-pot methode die meerdere DNA-fragmenten naadloos samenvoegt met exonuclease, polymerase en ligase.

Wat is Golden Gate Assembly?

Clonering met Type IIS-restrictie-enzymen die specifieke overhangs genereren; meerdere fragmenten in een vaste volgorde.

Wat is een MCS (multiplex cloning site)?

Regio met meerdere restrictieplaatsen in een vector voor insertie.

Wat is ori (origin of replication)?

Startplaats waar replicatie van DNA-moleculen begint.

Wat is AmpR?

Ampicilline-resistentiegen; gebruikt voor selectie van getransformeerde cellen.

Wat is lacZ' en wat betekent blauw-wit screening?

lacZ' gen; bij insertie wordt lacZ' geïnactiveerd; blauwe koloniën geven aan dat er geen insert is.

Wat doet uidA (Gus-test)?

Codeert voor β-glucuronidase; X-gluc wordt blauw wanneer het enzym actief is.

Wat doet SUP4-gen in gist?

Suppresser voor ADE/URA-systeem; bepaalt koloniekleur (wit/rood) bij selectie.

Wat doen Leu2, TRP1, HIS3 en URA3 in gist?

Selectiegente voor respectievelijk leucine, tryptofaan, histidine en uracilbiosynthese; bepalen groei op specifieke media.

Wat is YE p, YIp, YRp en YAC?

YEp: yeast episomal plasmid; YIp: integratieve plasmide; YRp: replicatief plasmide; YAC: yeast artificial chromosome (grotere inserts).

Wat is BAC?

Bacteriële kunstmatige chromosomen; kunnen tot ~350 kb DNA dragen; grote clones.

Wat zijn cos-sites in lambda-fagen?

Cohesieve uiteinden die bij ligatie van lineair DNA tot circulair DNA leiden; cruciaal voor integratie.

Wat is lambda-fage cloning en wat is een profaag?

Lambda-fage gebruikt virale vectoren; circulair DNA kan in het Bacterie-genoom integreren tot profaag; lysogene vs lytische cyclus.

Wat is phagemide en hoe verschilt het van M13?

Phagemide is een phage-vector met beperkte capaciteit maar gekoppeld aan helper-fagen; kleinere inserts dan lambda, groter dan M13.

Wat is M13-fage en waarom is het handig?

Enkelstrengig DNA-virus; infecteert zonder cel lyse; handig voor sequencing en analoge toepassingen.

Wat is CTAB en waarvoor gebruik je het?

Cetyltrimethylammoniumbromide; trekt nucleïnezuuren complexvorming aan, veel gebruikt bij plant-DNA-opzuivering.

Wat is EDTA en wat doet het in DNA-opzuivering?

Chelateert Mg2+-ionen; destabiliseert enzymen en celwand; helpt bij DNA-vaste extractie.

Wat is Guadinium thiocyanaat (GTC) in DNA-opzuivering?

Chaotropisch zout; denatureert eiwitten en laat DNA aan silica vastplakken; afhankelijk van zouten voor binding.

Wat is fenol/chloroform-extractie?

Organische extractie die DNA scheidt van eiwitten/organische componenten; drie lagen na centrifugatie.

Wat is Ethidiumbromide en wat zijn de veiligheidsalternatieven?

Intercalerende stof die DNA-lagen oplicht onder UV; EtBr is schadelijk; vaak vervangen door SYBR Safe.

Wat is een CsCl-densiteitsgradient centrifugatie?

Scheiding op basis van dichtheid tussen plasmide-DNA en hoofdchromosoom; plasmiden hebben lagere densiteit.

Wat is TRIzol en waarvoor gebruik je het?

Monofasige fenol/guanyl-isoothiocyanate-oplossing voor total RNA-extractie; scheiding van RNA, DNA en eiwitten.

Wat is RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)?

Techniek om 5' of 3' uiteinden van mRNA/CaDNA te amplificeren; helpt bij het identificeren van start/stopposities.

Wat is een pre-mRNA en wat gebeurt ermee in eukaryoten?

Pre-mRNA is het ruwe transcript dat nog gespliced en gecap wordt; daarna rijpt het tot mRNA.

Wat is het verschil tussen HRT en HART?

HRT: hybrid-release translation; mRNA wordt vertaald na hybridisatie met celvrij mRNA op een membraan. HART: hybrid-arrest translation; mRNA wordt vertaald behalve het onderzochte mRNA.

Wat is een promotor in DNA?

Sequentie waar RNA-polymerase op start; reguleert transcriptie van nabijgelegen genen.

Wat is een transcriptiefactor?

Regulerend eiwit dat bindt aan DNA-sequenties en transcriptie van genen verhoogt of verlaagt.

Wat is een repressor?

Transcriptiefactor die de transcriptie van een gen inhibeert, vaak door blokkeren van RNA-polymerase.

Wat is een probe in moleculaire biologie?

Een kort gelabeld DNA- of RNA-fragment dat hybridiseert met een specifieke sequentie in het doel-DNA.

Wat is kolonie hybridisatie probing?

Kolonien op membraan; DNA wordt losgemaakt en gebonden probe geeft aan of insert aanwezig is.

Wat is DIG-labeling?

Digoxigenine-label; detectie via anti-DIG anticorpo's; veelal met enzym- of fluorescentie-readout.

Wat is HRP-labeling?

Horse radish peroxidase gekoppeld aan probe; luminescente reactie bij aanwezigheid.

Wat is een fluorescente label in probes?

Fluorochromen (bijv. FITC) gekoppeld aan nucleotiden voor fluorescentie-detectie.

Wat is een probe met biotine en avidine?

Biotine aan probe; bindt sterk aan avidine-met-fluorescent-label; detectie via fluorescentie.

Wat is een strand (blunt) end vs sticky end in kloneren?

Blunt eind: rechte uiteinden; sticky end: overhangende uiteinden die complementariteit mogelijk maken.

Wat is een linker bij DNA-ligation?

Blunt-end fragment dat extra overhangs toevoegt zodat insert in vector past.

Wat is een adapter bij DNA-klonering?

Oplosbaar uiteinde met overhang; zorgt voor compatibiliteit met vector EN restrictieplacing.

Wat is een homopolymere tailing?

Kleiner tail; toevoegt een herhaal van één nucleotide aan 3’ eind; helpt bij ligatie.

Wat zijn restrictie-enzymen (RE) en wat doen ze?

Enzymen die specifieke DNA-herkenningsplaatsen knippen; leiden tot blunt of sticky ends.

Wat is een pUC-vector en wat is hun voordeel?

Een veelgebruikt plasmide met lacZ’, MCS en hoge kopie; snelle blauw-wit screening.

Wat is een pET-vector?

Expressievector voor hoge niveau van RNA/eiwitproductie; vaak T7-promotor en strong translation elements.

Wat is een cosmide?

Cos-site-containing plasmide die kan inpakken als cosmidvector; grotere inserts dan M13/M13mp.

Wat is een phagemide?

Kloonvector die phage-elementen bevat; kleiner dan lambda maar kan grotere inserts dragen dan M13.

Wat is een BAC? (revisited)

Bacterieel kunstmatig chromosoom; kan tot 350 kb DNA dragen; ideaal voor grote genetische stukken.

Wat is een transposon (P-element) in Drosophila?

Kleine DNA-sequenties die in het genoom kunnen bewegen; P-elementen worden gebruikt als kloonvectors in fruitvliegonderzoek.

Wat is CRISPR-Cas?

Site-directed nuclease-technologie die genomische doelwitten specificeert met guide RNA; knipt DNA op doellocatie.

Wat is een PAM-site?

Protospacer adjacent motif; korte sequentie die nodig is voor Cas-nuclease binding en knipactiviteit.

Wat is het verschil tussen Sanger en NGS?

Sanger is eerste generatie/sequentie via ddNTP's; NGS (Illumina, etc.) is high-throughput en parallel.

Wat is de functie van een promotor in vectoren?

Stuurd regulatie van genexpressie; bepaalt wanneer en hoeveel een insert wordt getranscribeerd.

Wat is een primer in PCR?

Korte DNA/ RNA-sequentie die aan matrijs bindt en startpunt biedt voor DNA-synthese.

Wat is een 5' end labeling?

Labeling aan de 5'-kant van een DNA/RNA-nucleïnezuur; gebruikt bij probe-labeling.

Wat is een 3' end labeling?

Labeling aan de 3'-kant; kan gedaan worden met terminal deoxynucleotidyl transferase.

Wat is een primer-dimer?

Ongewenste bindingswijze tussen primers die amplificatie van primer-DNA veroorzaakt.

Wat is een effen 3’ eind (3' end) bij PCR primers?

Primers eindigen bij C of G aan het 3'-uiteinde om sterke binding mogelijk te maken.

Wat is een smelttemperatuur (Tm) in primerontwerp?

Temperatuur waarbij helft van de primers-DNA-strengen gedenatureerd is; vaak 1-3°C onder Tm van primers.

Wat is een RACE-appendix (5' of 3' ends)?

RACE wordt gebruikt om ontbrekende 5' of 3' uiteinden van mRNA te verkrijgen.

Wat is microarray-technologie?

DNA-oligonucleotiden op een chip; hybridisatie met gelabeld cDNA om genexpressie te meten.

Wat is RNA-sequencing (RNA-Seq)?

Sequencing van het volledige mRNA-transcriptome via cDNA en NGS; bepaalt expressie en transcriptstructuur.

Wat is SAGE (Serial Analysis of Gene Expression)?

Korte 12-bp tags worden gebruikt om mate van genexpressie te bepalen via koppeling en sequencing.

Wat betekent 'marker genes' in cloning?

Merkergen identificeert klonen en controleert transformatie; vaak antibiotica-resistentie of reporter-gene.

Wat is het doel van een 'probe' bij cloning?

Bevestigen of een kloon het juiste DNA fragment bevat; detectie door hybridisatie.

Wat is 'hot-start' PCR?

PCR-kinetiek wordt uitgeschakeld tot de eerste denaturatiestap; verhoogt specificiteit en reduces artefact.

Wat is 'ddNTP-labeling' in Sanger sequencing?