Prácticas biocel

Conjunto de técnicas que permiten el

mantenimiento in vitro de las células manteniendo al máximo

sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas

Cultivos celulares

4 Modos de crecimiento en cultivos celulares

• En suspensión: las células crecen dispersas en el medio de cultivo, no necesitan estar ancladas a ningún soporte.

• En adhesión: las células crecen adheridas a la placa de cultivo formando una monocapa de células

• Cultivo primario: aislamiento de células que residen en los tejidos para que proliferen en la placa de cultivo aportándoles las condiciones adecuadas.

• Pase de células: transferencia de un número pequeño de células a una nueva placa de cultivos para prolongar el cultivo

Fórmula del recuento celular

¿Por qué las células aparecen formando una monocapa, por qué no se observan tumoraciones?

Porque presentan inhibición por contacto

¿Cuál es la función de EDTA y por qué se añade a la solución de digestión?

El EDTA es un quelante (secuestrador) de calcio. Algunas moléculas de adhesión, como por ejemplo las cadherinas, son dependientes de calcio. Al eliminar el calcio se debilitan esas interacciones y se facilita la acción de la tripsina.

Es una enzima (una proteasa) que corta las proteínas encargadas de que las células se adhieran entre sí o al frasco de cultivo

Tripsina

Capacidad que presentan algunas moléculas de absorber energía y emitirla en forma de

rayos luminosos.

Fluorescencia

La primaria ocurre en muestras que no han sido tratadas con ninguna molécula fluorescente debido a que hay compuestos en los tejidos que presentan propiedades fluorescentes
Y la secundaria se produce gracias a la adición de fluorocromos a la muestra

Molécula fluorescente, en su mayoría hidrocarburos poliaromáticos o heterocíclicos

Fluorocromo

rango del espectro en el cual el fluorocromo

es capaz de excitarse, con un pico en una longitud de onda (excitación)

a la cual la excitación es máxima

Espectro de absorción

rango del espectro en el cual el fluorocromo

emite la fluorescencia tras la excitación, con un pico en una longitud

de onda (emisión) a la cual la emisión es máxima

Espectro de emisión

Qué es lo ideal en los fluorocromos?

Ideal: espectros de absorción parecidos y espectros de emisión muy

diferentes

MICROSCOPÍA CONFOCAL. La luz recibida para su observación es la que proviene únicamente de un plano de la muestra, eliminando la que procede de los planos no enfocados. Esto es posible gracias a los ____

Pinholes

Tinte para estimar la viabilidad de la: integridad de la membrana plasmática, la función mitocondrial y la función lisosómica y tinción de núcleos

azul tripano, ioduro de propidio.

MTT, mitotracker, rodamina 123

rojo neutro.

ioduro de propidio, el Hoechst, el DAPI o el naranja de acridina, junto a la hematoxilina de Gill

Técnica histológica para la preparación de muestras. Pasos

Fijación

Inclusión

Corte

Tinción

Observación

Penetra en la muestra, para cortar con ultramicrotomo

Resinas

Sustitución del agua intracelular por un sólido que permita una consistencia adecuada para el corte del tejido y la obtención de secciones muy finas

Inclusión

Interrupción de los procesos de degradación que conlleva la muerte celular, asegurando la

máxima conservación posible de la cito-arquitectura y características químicas de las células y los tejidos.

Los tipos de fijación son muy variados y dependen de la finalidad para la que se vaya a utilizar la muestra. Los

defectos de fijación no se pueden corregir durante el resto del procesado histológico

Fijación

Física para muestras fluidas como células en suspensión o tejidos (se usa calor/frío)
Química para tejidos órganos, o animales completos por la acción de agentes fijadores que desnaturalizan o precipitan las proteínas tisulares

por la acción de agentes fijadores que

desnaturalizan o precipitan las proteínas

tisulares

Parafina

No penetra en la muestra, sólo rodea. Para cortar con vibrátomo.

Gelatina/agar

cortes de entre 50 y 200 μm.

• Para microscopía óptica

Vibrátomo

cortes de entre 1,5 μm y 70 nm.

• Para microscopía electrónica

Ultramicrotomo

cortes de menos de 50 μm.

• Para microscopía óptica

Microtomo de parafina

Tinción nuclear y de los cuerpos de Nissl (acumulaciones de retículo endoplasmático rugoso en neuronas)

Tinción de cresilo

La mayoría de órganos, tejidos y células posen color, aunque hay muchos que necesitamos teñir porque son incoloros V/F

F
La mayoría de órganos son incoloros (excepto algunos muy vascularizados, como el hígado; o con muchos melanocitos, como la piel) Para poder observarlos necesitamos teñirlos

Por qué hay que desparafinar e hidratar la muestra antes de la tinción?

Se desparafina para eliminar la parafina que es hidrófoba y actúa como una barrera que impide el acceso de los colorantes al tejido, y se hidrata para devolver agua al tejido de forma progresiva, ya que la mayoría de las tinciones se realizan en medio acuoso y requieren una muestra hidratada para que los colorantes se unan correctamente a las estructuras celulares

El glutaraldehído se utiliza para facilitar el uso de colorantes que penetren en la muestra V/F

F
Una forma sencilla de verlo es imaginar que los colorantes buscan "sitios de anclaje" en las moléculas del tejido. El glutaraldehído cubre o modifica parte de esos sitios, por lo que el colorante encuentra menos lugares donde unirse.

Sustancia que ayuda a que el colorante se fije mejor al tejido y es propiedad de algunos fijadores

Efecto mordiente

Cuál es la base química de los colorantes, que grupos necesita para que le den color y que grupos le permiten unirse al tejido (fabricar un colorante)

Anillos aromáticos derivados del benceno, grupos cromóforos y grupos auxocromos o potenciadores del color

Anillo aromático + cromóforo = cromógeno (tiene color)

Cromógeno + auxocromo = colorante (tiene color y puede teñir tejidos)

Nombra los colorantes naturales (obtenidos de plantas e insectos)

• Hematoxilina: se obtiene

del “palo azul” de

Centroamérica.

• Carmín: rojo.

• Safranina: amarillo.

Derivado del azafrán

Nombra los colorantes artificiales (derivados mayoritariamente del benceno (anillos aromáticos))

• Violeta de cresilo.

• Azul de toluidina.

• Fucsina.

• Rojo neutro.

Nombra los colorantes básicos (tiñen estructuras ácidas) (colorantes nucleares)

Hematoxilina, carmín, fucsina básica, rojo neutro, violeta de cresilo

Nombra los colorantes ácidos (tiñen estructuras básicas) (colorantes citoplasmáticos)

Eosina, fucsina ácida

Los colorantes ácidos (citoplasmáticos) son más específicos que los colorantes básicos (nucleares) V/F

F
Son menos específicos

Colorantes que combinan una porción ácida y una básica, forman un

precipitado salino.

Colorantes neutros

Las estructuras teñidas muestran varias tonalidades (tonalidad policroma)

• Tinción de Giemsa

Tipo de tinción que Proporciona una visión panorámica del conjunto del tejido en la que se pueden separar los diferentes componentes estructurales. Se obtienen aplicando varios colorantes de forma simultánea (Giemsa) o secuencial (Van Gieson)

Tinción topográfica

Tipo de tinción para resaltar diversas estructuras de la célula o del tejido, como núcleos, RE, fibras elásticas, etc

Tinción estructural

Tipo de tinción donde los colorantes reaccionan por afinidad histoquímica (Ej: el azul alcián tiñe específicamente mucopolisacáridos ácidos marcando las células caliciformes del intestino) o mediante inmunohistoquímica, haciendo uso de anticuerpos específicos

Tinción histoquímica

Sucede cuando diversas estructuras tisulares adquieren una coloración diferente usando un mismo colorante. Dichas estructuras se denominan cromótropas. Las que presentan la coloración normal se denominan ortocromáticas

Metacromasia

Con qué desparafinamos?

Isoparafina

Qué tenemos que hacer para hidratar una muestra si no queremos que se dañen los tejidos o haya roturas o deformaciones? y para deshidratar?

Para hidratar (añadir agua) tenemos que echar alcohol en cantidades decrecientes, cada vez menos alcohol. 100% → 96% → 70% → agua destilada

Para deshidratar (quitar agua) → cada vez más alcohol

agua destilada → 70% → 96% → 100%

Por qué el microscopio electrónico tiene mayor resolución que el óptico?

porque los electrones tienen una λ mucho menor que los fotones (hasta 0,1 nm frente a los 200 nm del óptico)

El metal que se une específicamente a los ácidos nucleicos es el

Acetato de Uranilo

El metal que se une específicamente a las proteínas es el

Citrato de plomo

Resultado de tinción de Van Gieson

Los núcleos son negros/violetas, el citoplasma amarillo y el colágeno fucsia

La apertura numérica de un microscopio es lo mismo que el número de aumentos V/F

F

• Número de aumentos: Indica cuántas veces más grande se ve la imagen de la muestra en comparación con su tamaño real (por ejemplo, 40x o 100x.

• Apertura Numérica (A.N. o N.A.): Es un valor adimensional que mide la capacidad de la lente para captar luz y resolver detalles finos (nitidez)

Qué diferencia el microscopio electrónico del óptico?

• Que tiene mayor resolución porque cambia la luz por un haz de electrones que tienen menor longitud de onda (x lo que posee una mayor resolución y aumento)

• Se ve en blanco y negro por la pantalla de fósforo

• La tinción requiere de contrastarlo porque el material biológico es transparente a los electrones y se realiza con las sales de metales pesados

• Se necesitan cortes ultrafinos y trabajar con los electrones en alto vacío

• No permite observar células vivas