Practicum deel 2

linkage

het principe dat hoe dichter twee genen of markers op een chromosoom bij elkaar liggen, des te groter de kans is dat ze gezamenlijk als één eenheid overerven

Belangrijk voor genomische positie van de mutatie in kaart te brengen

• De mutatie moet een zichtbaar fenotype geven; anders weet je niet welk gen je mapt.

• De plaats van de markers op het genoom moet bekend zijn; anders weet je niet waar je zit.

• Je moet een populatie recombinante nakomelingen hebben van je mutant gekruist met een individu met een iets andere (= polymorfe) DNA sequentie; anders heb je niks aan je markers. Als je mutant in het Ler ecotype zit dan kruis je hem met een plant van Col-0 ecotype. De F2 populatie gebruik je voor het mappen.

Wat zijn InDel-markers en hoe worden ze gebruikt in Experiment 2.1?

• InDel-markers zijn insertie/deletie markers die een lengteverschil in een specifiek DNA-gebied tussen verschillende Arabidopsis-accessies (zoals Ler en Col-0) laten zien.

• Deze variatie ontstaat doordat in de ene accessie een klein stukje DNA is toegevoegd (insertie) of verwijderd (deletie) ten opzichte van de andere accessie.

• gebruikt om de positie van het gemuteerde gen te bepalen

DNA-isolatie uit planten (Quick DNA extraction for PCR)

1. extractiebuffer —> micro pestle + blad

2. 60 graden (45min)

3. supernatant + isoprop

4. kamertemp

5. pellet + EtOH

6. pellet = droog —> mQ

7. -20 graden bewaren

Extractie buffer (4 onderdelen(

• NaCl (2 M)

• Tris-HCl (pH 8) (200 mM)

• EDTA (70 mM)

• Na2S2O5 (20 mM)

loading dye

Orange G en glycerol

zichtbaar maken elektroforese

ethuimbromide

• Deze fluorescerende kleurstof bindt zich tussen de basenparen van het DNA.

• Wanneer de gel onder UV-licht wordt bekeken, zal het DNA oplichten, waardoor de fragmenten zichtbaar worden.

gel gieten

• normaal 0.8%, nu 4%

• opgekookt en afgekoeld tot 60 graden

• EtBr

• na 30 min klaar

• voltage: 80-150V

een standaard PCR-mengsel:

• X μl DNA (x ng/µl)

• 5 μl Taq PCR-buffer (10x PCR buffer)

• 0.5 μl dNTP’s (10mM)

• 1 μl forward primer (10 μM, ofwel 10 pmol)

• 1 μl reverse primer (10 μM, ofwel 10 pmol)

• 1 μl Taq (1U/μl)

• Y μl milliQ (mQ) water

• »»»»»
  50 μl (totaalvolume)

een standaard PCR-programma

1. 3’ 94°C

2. denaturation 30” 94°C
   complementaire DNA-ketens laten los —> enkelstrengs DNA

3. annealing 30” 40-65°C
   Oligonucleotide primers binden aan complementaire seq —> beginpunt DNA-synthese (door TAq-DNA poly)

4. extension 2’ 72°C
   Taq-DNA-poly begint met DNA-synthese vanaf de primers

5. 5’ 72°C

6. 4°C forever

stap 2-4 doe je eerst 20-40 cycli voordat je doorgaat naar stap 5

Leg uit wat een DNA-marker is en hoe deze wordt gebruikt bij linkage mapping.

• Een DNA-marker is een specifiek gen of DNA-sequentie waarvan de locatie op een chromosoom bekend is.

• Bij linkage mapping wordt gebruik gemaakt van het principe dat genen of markers die dicht bij elkaar op een chromosoom liggen, een grotere kans hebben om samen over te erven.

• Door de recombinatiefrequentie tussen verschillende DNA-markers en de te onderzoeken mutatie te bepalen, kan de genomische positie van de mutatie in kaart worden gebracht.