biolo molo bazunia 2

euchromatyna

postać chromatyny, która powstaje wskutek działania acetylotransferazy histonowej powodującej osłabienie powinowactwa białek histonowych do DNA

biotynylacja

przyłączenie biotyny do enzymów katalizujących reakcję karboksylacji kwasów organicznych

cięcie

rodzaj obróbki potranslacyjnej powszechny w przypadku białek wydzielanych na zewnątrz komórki, których aktywność biochemiczna mogłaby być szkodliwa dla komórek je wytwarzających

proopiomelanokorytyna

hormon peptydowy kręgowców zawierający 10 różnych hormonów uwalnianych podczas cięcia

inteiny to

wewnętrzne segmenty białek

poliproteina

długi peptyd zawierający kilka białek połączonych jedno za drugim i syntetyzowany jako jedna cząsteczka

melityna

główne białko jadu pszczelego

glikozylacja

chemiczna modyfikacja białka polegająca na dodaniu bocznego łańcucha cukrowego

peptyd sygnałowy

specyficzne sekwencje aminokwasowe znajdujące się w obrębie białka określające ostateczną lokalizację protein w komórce to

acetylacja

chemiczna modyfikacja białka polegająca na dodaniu grupy acetylowej do aminowej zachodząca w obrębie reszt argininy lub lizyny białek histonowych

acylacja

chemiczna modyfikacja białka polegająca na przyłączeniu długich łańcuchów lipidowych do seryny lub cysteiny

metylacja

modyfikacja białek, która nie wpływa bezpośrednio na zmiany strukturalne chromatyny ale powoduje utworzenie miejsc wiązania dla innych białek, które w

chaperony

inna nazwa białek opiekuńczych

miRNA po raz pierwszy odkryto u

roślin

założeniem medycyny spersonalizowanej 4P jest takie zachowanie i styl życia pacjenta, aby zmniejszyć ryzyko zachorowania - cecha ta to inaczej

prewencyjność

do analizy RNA wykorzystujemy mikromacierze

transkryptomiczne

sondy wykorzystywane do konstrukcji mikromacierzy powinny

być komplementarne do końca 3’ transkryptu

to metoda sekwencjonowania oparta o syntezę, przyłączaniu kolejnych nukleotydów do syntetyzowanej nici DNA towarzyszy uwolnienie PPi. uwolniony PPi konwertowany jest do ATP przez sulfurylazę ATP. kolejnym etapem jest uwolnienie kwantu światła w reakcjach przemiany ATP do AMP katalizowanych przez lucyferazę. opis dotyczy

pirosekwencjonowania

znakowanie sond molekularnych może odbywać się na różne sposoby, znakowanie kompleksem biotyna-streptawidyna lub dioksygenina-powierzchnia ciała to przykład znakowania

haptenem

prawdą jest, że hybrydyzacja in vitro

jest poprzedzana ekstrakcją kwasu nukleinowego z komórek

przykładem hybrydyzacji in-vitro na podłożach stałych jest technika Southern-blot, dedykowana do analizy

DNA

nothern - RNA

western - białka

w technikach hybrydyzacji in situ stosuje się różne sondy molekularne - sondy malujące, centromerowe czy telomerowe są stosowane w technice

FISH

jednym z czynników mających wpływ na utrwalanie komórek w technice PCR in situ jest temperatura, zalecana temperatura do przeprowadzania tego etapu to

4C

przeprowadzenie detekcji białek enzymatycznych i ich rozdział elektroforetyczny wymaga zachowania struktury II i III rzędowej białka, do tego typu cząsteczek zastosujemy elektroforezę

w żelu natywnym

wybierz hybrydyzację, która jest techniką in-situ

fluorescencyjna hybrydyzacja FISH

zdanie fałszywe o sondach molekularnych

sondy molekularne nie muszą być bardzo specyficzne względem powielanego fragmentu

w technice northern blotting

jako matrycę wykorzystujemy RNA

southern - zdenaturowane DNA

western blot - etapy

1. rozdział elektroforetyczny białek

2. transfer

3. zablokowanie membrany

4. wiązanie przeciwciał

5. detekcja białek

które z wymienionych warunków mają wpływ na utrwalanie w formalinie kwasów nukleinowych w reakcji PCR in situ

wszystkie wymienione:

• czas przed przystąpieniem do utrwalania

• pH

• czas utrwalania

mikromacierze oligonukleotydowe to przykłąd techniki hybrydyzacji należącej do hybrydyzacji

in vitro, na nośniku

poprawnie wymienione etapy PCR in-situ

1. utrwalanie komórek w formalinie

2. trawienie proteinazą K

3. amplifikacja in-situ

4. immunodetekcja

oligonukleotydy o długości 20-30pz znakowanie barwnikiem fluorescencyjnym (reporterowym na końcu 5’ oraz barwnikiem wygaszającym quencher na końcu 3’, to sonda

TaqMan

elektroforeza dwukierunkowa 2DE

początkowo białka rozdzielane są w zależności od punktu izoelektrycznego następnie zgodnie z ich masą cząsteczkową

podczas PCR in situ zbyt długi czas trawienia powoduje

powoduje zniszczenie struktury komórkowej i utratę amplifikowanych kwasów podczas kolejnych etapów procedury

fosforylacja to

reakcja przyłączania reszty fosforanowej przez kinazy

zaburzenia w prawidłowym funkcjonowaniu szlaku ubikwityna-proteasom stanowią przyczynę wielu chorób

prawda

techniki biologii molekularnej można zastosować w diagnostyce klinicznej

wszystkie odpowiedzi:

• zakażeń

• nowotworów

• chorób o charakterze genetycznym

podczas PCR in situ zbyt krótkie trawienie

uniemożliwia inkorporację składników, mniej wydajna amplifikacja

zbyt długie trawienie podczas reakcji PCR in situ

powoduje zniszczenie struktury komórkowej i utratę amplifikowanych kwasów podczas kolejnych etapów procedury

potranslacyjna obróbka białek obejmuje usunięcie sekwencji wewnętrznych i połączenie sekwencji zewnętrznych. sekwencje zewnętrzne tworzące ostateczną sekwencję białka to

eksteiny

prawdą jest, że białka opiekuńcze Hsp 70

nie decydują o trzeciorzędowej strukturze innych białek, pomagają im tylko odnaleźć prawidłową strukturę

cięcie proteolityczne jest popularnym procesem obróbki potranslacyjnej poliprotein skutkujące wytworzeniem segmentów, z których wszystkie lub część stają się aktywnymi białkami. hormon występujący u kręgowców, zawierający 10 różnych hormonów uwalnianych podczas cięcia jest

propioomelanokorytna

modyfikacja białek, która nie wpływa bezpośrednio na zmiany strukturalne chromatyny ale powoduje utworzenie miejsc wiązania dla innych białek, które wpływają na jej kondensację to

metylacja

3 wady wykonywania badań genetycznych

• skomplikowane i długie procedury

• drogie odczynniki i aparatura

• kwestie etyczne

analiza krzywej topnienia produktu PCR polega na stopniowym podnoszeniu temperatury mieszaniny aż do momentu denaturacji DNA i pomiarze fluorescencji co 0,2-0,5 C. w momencie osiągnięcia temperatury topnienia produktu następuje bardzo gwałtowna denaturacja i obserwowany jest ostry

spadek fluorescencji

barwnik SYBR Green I łączy się z dsDNA (nie wiąze się z ssDNA) w wyniku połączenia wzrasta fluorescencja, wzrastająca ilość nowo syntetyzwoanych nici powoduje wzrost sygnału fluorescencyjnego - ta zasada detekcji produktu PCR dotyczy

detekcji nieswoistej

metoda wyznaczania początkowej ilości matrycy w której ilość badanej sekwencji w próbach nieznanych wyrażona jako krotność jej ilości w próbie referencyjnej (kalibratorze)

metoda względna - relatywna

zdanie fałszywe - geny referencyjne w reakcji qPCR

powinny ulegać zmianom w poziomie ekspresji pod wpływem badanego czynnika lub różnić się wyjściowo ekspresją pomiędzy badanymi grupami

technika hybrydyzacji polegająca na detekcji kwasu nukleinowego bezpośrednio w miejscach jego naturalnego występowania - w komórce, tkance to hybrydyzacja

in situ

w trakcie translacji czynnik elongacyjny EF-Tu w komórkach prokariotycznych pełni rolę

• odpowiada za przyłączenie aminoacylo tRNA i zabezpiecza wiązanie estrowe między aminokwasem a tRNA przed rozkładem przez hydrolizę

• dostarcza aminoacylotRNA do miejsca A na rybosomie

dlaczego temperatura topnienia tm sondy molekularnej powinna być wyższa niż tm starterów

aby sonda hybrydyzowała do matrycy wcześniej niż startery

cząsteczka MGB w sondzie MGB pełni funkcję

stabilizatora wiązania sondy z DNA podnoszącego Tm

dlaczego w metodzie southern blot konieczna jest denaturacja DNA przed transferem na membranę

ponieważ sonda może hybrydyzować tylko z jednoniciowym DNA

molekularna technika cytogenetyczna, która pozwala rozróżnić chromosomy pochodzące od rodziców na podstawie różnicowej hybrydyzacji z kompletnymi sondami genomowymi

GISH

sondy używane do detekcji aberracji strukturalnych, komplementarne dla określonych genów lub unikalnych sekwencji nukleotydowych to

sondy specyficzne

etapy PCR in situ

utrwalanie komórek w formalinie → trawienie komórek proteinazą K → amplifikacja in-situ → immunodetekcja

jakie skutki wywołuje zbyt długi czas utrwalania formaliną na kwasy nukleinowe

powoduje krzyżowe połączenia grup aminowych białek z kwasami nukleinowymi

substratem dla enzymu fosfatazy alkalicznej wykorzystywanej w teście ELISA jest

fosforan p-nitrofenolu

w metodzie SDS-Page w celu denaturacji białka używa się

SDS wraz z betamerkaptoetanolem

które najlepiej opisuje zasadę działania metody PEA _ proximity Extension Assay

opiera się na użyciu dwóch przeciwciał związanych z oryginalnymi oligonukleotydami wyznakowanymi fluoroforami, które po związaniu się w pobliżu ulegają hybrydyzacji i amplifikacji

które z poniższych stwierdzeń najlepiej opisuje metodę BioPlex 3D

metoda wykorzystuje kulki z mikrosferami barwione dwoma fluorochromami do jednoczesnej detekcji wielu analizatów w próbce, a odczyt opiera się na pomiarze fluorescencji specyficznej dla każego analyta

potranslacyjna obróbka białek powoduje usunięcie sekwencji “przerywnikowych” występujących w niektórych białkach. są to

inteiny

podczas obróbki potranslacyjnej białek sfałdowanie prowadzi do wytworzenia prawidłowej struktury

III-rzędowej białka

cięcie proteolityczne jest popularnym procesem obróbki potranslacyjnej w odniesieniu do białek wydzielanych na zewnątrz komórki, których aktywność biochemiczna mogłaby być szkodliwa dla komórek je wytwarzających - przykładem takiego białka jest

melityna

chemiczna modyfikacja białka polegająca na przyłączeniu długich łańcuchów lipidowych do seryny lub cysteiny to

acylacja

analiza topnienia produktu PCR wyznakowanego barwnikiem SYBR Green jest przeprowadzana

do oceny specyficzności reakcji qPCR

metoda wyznaczania początkowej ilości matrycy wykorzystująca krzywe wzorcowe sporządzone w oparciu o serie rozcieńczeń roztworu zawierającego znane stężenia powielanej sekwencji to

metoda bezwzględna (absolutna)

detekcja za pomocą hybrydyzacji różnych typów oligonukleotydów wyznakowanych fluorochromami np. sond molekularnych to

detekcja swoista

w reakcji qPCR podstawą obliczeń jest cykl progowy Ct (cq, Cp), czyli cykl, w którym krzywa amplifikacji

przetnie linię progową - treshold a wartość Ct jest odwrotnie proporcjonalna do ilości materiału początkowego

technika hybrydyzacji, w której kwas nukleinowy najpierw jest ekstrahowany z komórek a następnie analizowany poza komórką, to hybrydyzacja

in vitro

do metod hybrydyzacji na błonie nitrocelulozowej należy

Dot-blot

które z poniższych nie jest cechą dobrze zaprojektowanej sondy molekularnej

Tm sondy niższe niż starterów o 5C

w sondzie Taqman wyciszenie fluorescencji następuje dzięki

zjawisku FRET między barwnikiem reporterowym a wygaszającym

w trakcie translacji czynnik elongacyjny EF-Tuw komórkach prokariotycznych pełni rolę

odpowiada za przyłączenie aminoacylo tRNA i zabezpiecza wiązanie estrowe między aminokwasem a tRNA przed rozkładem przez hydrolizę

dostarcza aminoacylo tRNAdo miejsca A na rybosomie

do metod pośredniej hybrydyzacji in-situ należy

hybrydyzacja z użyciem chromogenu

sondy komplementarne do DNA na całej długości chromosomów lub ich poszczególnych ramion szczególnie przydatne do analizy translokacji to

sondy malujące

który warunek podczas utrwalania formaliną wzmacnia sygnał hybrydyzacji in-situ

podwyższone pH formaliny

substratem dla enzymu peroksydazy chrzanowej wykorzystywanej w teście ELISA jest

tetrametylobenzydyna

w metodzie Western Blot w celu zablokowania membrany używa się

odtłuszczonego mleka lub albuminy z surowicy bydlęcej

jakie są różnice między techniką PCR a RT-qPCR

• PCR analizuje DNA

• RTqPCR RNA (przed amplifikacją jest odwrotna transkrypcja → cDNA)

• ocena specyficzności produktu w PCR po reakcji na żelu a w RTqPCR w czasie rzeczywistym

na co należy zwrócić uwagę podczas projektowania starterów do reakcji RTqPCR

• długość starterów 18-28 nukleotydów

• temp. meltingu starterów zbliżona (55-72C)

• skład GC 40-60%

• specyficzność starterów i sondy

• temp. annealingu o 5C mniej niż meltingu straterów

• należy unikać komplementarności ostatnich 2,3 nt na końcach 3’pary starterów

• unikać sekwencji komplementarnych wewnątrz startera i między parą

• sekwencja startera pozbawiona powtórzeń ciągu 1 nukleotydu np. AAAA

podaj etapy ekstrakcji DNA metodą kolumienkową

1. liza komórek

2. naniesienie próbki na kolumienkę, związanie DNA ze złożem, przepłukiwanie złoża buforami

3. elucja, wypłukanie kwasów nukleinowych

podaj odczynniki wykorzystane podczas ćwiczenia laboratoryjnego do ekstrakcji DNA metodą kolumienkową oraz zastosowanie każdego z nich

• bufor QB - aktywuje kolumienkę'

• proteinaza K - usuwa białka

• bufor SolQB - detergent, usuwa lipidy

• Wash QBX1/QBX2 - bufory przemywające - pozbycie się zbędnych substancji

• elution bufor/woda - wymycie DNA

• etanol - wytrącenie

jakie czynniki decydują o doborze danej metody izolacji materiału genetycznego

• rodzaj badanego kw. nukleinowego - DNA genomowe, plazmidowe, mitochondrialne, RNA

• pochodzenie - roślinne, zwierzęce, bakteryjne, wirusowe

• rodzaj materiału do przeprowadzenia izolacji - tkanka, organ, krew, hodowla

• oczekiwane rezultaty - czystość, jakość, czas izolacji

• przeznaczenie - PCR, klonowanie

markery diagnostyczne

służą do rozpoznania choroby lub określenia jej rodzaju

markery predykcyjne

ocena prawdopodobieństwa odpowiedzi na określoną terapię

markery prognostyczne

dostarczają informacji o przebiegu choroby, także jej rokowaniu

jakie są przykłady praktycznego zastosowania technik elektroforetycznych

• ocena produktów PCR i kw. nukleinowych

• identyfikacja kw. nukleinowych

• technika oczyszczania DNA plazmidów

• rozdział DNA wg. wielkości

• określanie specyficzności reakcji PCR

• wykrywanie mutacji, polimorfizmów np. leków

zastosowania praktyczne poliakrylamid

• do analizy western blot

• rozdział białka

• kryminalistyka

fenol zasadowy używany jest do

ekstrakcji DNA

fenol kwaśny używany jest do

ekstrakcji RNA, powoduje zatrzymanie DNA w fazie organicznej

do wytrącania kw. nukleinowych służy

etanol absolutny czysty 96-98% lub izopropanol

do oczyszczania osadów służy

etanol 70%

przykłady firm biotechnologicznych

thermofisher, biorad, qiagen

zasady pracy pod komorą laminarną

• dezynfekcja rękawiczek przed, nie wyciąga się rąk, po wyjściu dezynfekcja

• warunki sterylne, fartuch, rękawiczki

• przemycie blatu, sprzątanie po skończonej pracy, zamknięcie szyby, włączenie UV

powtórzenie techniczne

powtórzenie kilku próbek w identycznych warunkach, te same odczynniki i ta sama matryca

powtórzenie biologiczne

powtórzenia amplifikacji w kilku próbkach z identycznie przygotowanymi odczynnikami i podobnie przygotowanymi ale nie tymi samymi matrycami

różnice między powtórzeniem technicznym a biologicznym

techniczne - ta sama matryca ileś razy

biologiczne - inna matryca

jaki jest cel wykorzystania kontroli endogennej w reakcji PCR

zapewnia wiarygodność i interpretowalność wyników PCR

gdy reakcja PCR przebiegnie prawidłowo, kontrola endogenna

gen obecny naturalnie w komórkach badanego organizmu - housekeeping gene np. GAPDH, ACTB potwierdza, że reakcja amplifikacji działa poprawnie i że brak sygnału nie wynika z błędu technicznego